Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

著者は、シンガポールのA * STARのサポートされています。さらに、MJFは、科学国立フェローシップとリー·クアンユーポスドクフェローシップの女性のためのA * STAR、国立科学奨学金、ロレアルでサポートされています。 YRはNIH ENCODEの助成金（R01 HG004456-01、R01 HG003521-01）でサポートされています。著者はまた、ビデオ編集およびさんミシェル·テオのために氏ギャラリー一覧ラヒム、シーンを撮影するため、特定の氏ケルビンイッセイ氏、チャン·カイ翔氏とシャーウィンガンの8ピクセルプロダクション、シンガポール、ビデオ撮影チームを認めるボイスオーバー。

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利害の衝突が宣言されません。

CHIA-PETは、転写調節における長距離相互作用を識別するために開発した方法です。 CHIA-PETライブラリの品質を決定する重要な要因の一つはChIP材料の品質です。 ビデオに示すように、プロトコルは、セルをクロスリンクするEGSとホルムアルデヒドの使用が組み込まれています。より長いスペーサーアームを有する第二架橋試薬と組み合わせて、ホルムアルデヒドの使用は、単独で3,11,15ホルムアルデヒドによってバインドできませんでしたタンパク質の結合に役立つ可能性があります。我々は、堅牢な結合部位との長距離相互作用9を示しているこの方法でライブラリを構築した。しかし、架橋やチップの条件は、関心のある各要因のために最適化し、あまりにも多くの架橋は、超音波処理により断片化が困難になり、おそらく偽のクロマチンの相互作用が生じる可能性があるので、それは過剰架橋に重要ではありませんする必要があります。クロマチンの相互作用CHIA-PETによって識別されるこのような蛍光in situハイブリダイゼーション4などの別の方法によって検証する必要があります。 我々はクロマチン材料の100 ngの最小をお勧めします。我々はクロマチン材料の50 ngから質の良いライブラリを構築しているが、我々は、出発物質の大量の、それにより、各ライブラリのアンプリコンと冗長性を最小限に抑え、16未満のPCRサイクルでCHIA-PETライブラリーの構築を許可することを観察した。この下の冗長性は、それによってシーケンスの少ない車線の、より包括的なクロマチンの相互作用マップを有効にすると、より高いユニークなマップされたタグも使用可能なデータの割合が高いと相関していた。各チューブのビーズの最終的な詰め量はそれぞれ磁気およびセファロースビーズに50μlと100μlのでなければなりません。パックされたビーズのボリュームが述べたよりも小さい場合、DNA有利子ビーズの損失を最小化するために同様に事前にクリアブランク磁気またはセファロースビーズを用いた最小のパックボリュームにもたらす以降のステップでの。ちびのヒントや大規模なコアチップは、セファロースビーズをピペッティングするために使用されるべきです。 次の変更は、以前公開されCHIA-PETプロトコル5次の組み込まれた。まず、磁気Gビーズを洗浄中に、サンプルの損失を最小限に抑えるために使用された。また、セルフライゲーションハーフリンカーまたは/およびアダプタのアンプリコンであることが100 bpおよび138 bpのおおよそのサイズの非特異的なバンドを同定した。したがって、我々は、PCR増幅の間に非特異的バンドを最小限に抑えるために、ビオチン化半リンカーと454 GS20アダプタの濃度を減少させた。近接ライゲーションボリュームは、その後の精製工程中のサンプルの損失を最小限に抑え、また、試薬コストを節約するために50ミリリットルから10ミリリットルに減少した。また、ストレプトアビジンビーズにCHIA-PET DNAの最大のキャプチャを確保するためにビーズにCHIA-PETのDNAを固定するためにインキュベーション時間の増加となりました。 近接ライゲーションステップの間、キメラライゲーションTHAtは、必然的に非特異的とランダムに生成されたin vivoでクロマチンの相互作用で真を表すものではありません。したがって、任意のCHIA-PET実験からのデータの品質を評価するために、キメラ率が特定の塩基バーコードTAAGとATGT 5を持つ2つの異なる半リンカーの使用から推定される。ハイスループットシーケンシングした後、CHIA-PETシーケンスは、最初の8を区別することができる特定のライゲーション産物と非特異的ライゲーション産物から派生したリンカバーの組成と配列について分析されます。知られているキメラの割合（すなわち、ヘテロABリンカー）は、社内でMCF-7 RNAポリメラーゼII CHIA-PETのライブラリが15％未満である本。 CHIA-PETのシーケンスは、その後、すなわち2つのカテゴリ、セルフライゲーションペットと間ライゲーションのペットに分類されます。間ライゲーションのペットがiから派生している間にセルフライゲーションのペットは、クロマチンの断片の自己環状化ライゲーションから得られる2つの異なるDNA断片の間NTER-ライゲーション。後者は、同じ染色体（染色体内間ライゲーションペット）、あるいは両方のタグが2つの異なる染色体（染色体間の相互連結PETS）にマッピングされ、各タグのゲノム距離に基づいて3つのカテゴリに分割さです。我々は、異なるカテゴリ8を整理するCHIA-PETツールのソフトウェアパッケージを開発しました。これは、ライブラリ内にあるDNA断片に基づいて行われます。一般的には、小さなチップの断片は、より高い解像度を提供し、4キロバイト程度であるこれらのRNAポリメラーゼII CHIA-PETライブラリをカットオフします。 さらに、実際のクロマチンの相互作用は相互作用クラスタ内の間ライゲーションのペットの数をカウントすることによって、ランダムノイズと区別することができます。言い換えれば、高いPETカウントのクラスタは、実際のクロマチンの相互作用8であることの確率が高いと言われています。 私たちの偽陽性をフ​​ィルタリングするには偶然によって間ライゲーションのペットを形成することができる高濃縮アンカーからの上昇は、統計分析のフレームワークは、2つのアンカー8の任意の間ライゲーションのペットのランダムな形成を考慮して策定されています。 結論として、CHIA-PET技術は、地球規模でのクロマチンの相互作用ネットワークをマッピングすることができます。 CHIA-PETでのチップの実装では、ライブラリの複雑さとバックグラウンドノイズの低減を可能にします。さらに、チップは、特定の転写因子5に関連付けられた特定のクロマチンの相互作用の検討を可能にし、クロマチンの相互作用に特異性を追加します。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 4から20パーセント勾配TBEゲル</td><td>インビトロジェン</td><td> EC6225BOX </td><td>ステップB、6.3 </td></tr><tr><td> PEGを用いた5×T4 DNAリガーゼバッファー</td><td>インビトロジェン</td><td> 46300018 </td><td>ステップB、2.2 </td></tr><tr><td> 6パーセントTBEゲル</td><td>インビトロジェン</td><td> EC6263BOX </td><td>ステップB、6.8 </td></tr><tr><td> AgilentのDNA 100アッセイ</td><td>アジレント·テクノロジー</td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3">ステップB、7.1 </td></tr><tr><td> Agilentの高感度DNAアッセイ</td><td>アジレント·テクノロジー</td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td>アジレントバイオアナライザ2100 </td><td>アジレント·テクノロジー</td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> （スピン-X）管フィルタを遠心</td><td>コー​​ニング&lt;/ TD&gt; <td> CLS8160 </td><td>ステップB、3.7と6.9 </td></tr><tr><td>ダークリーダーネーター</td><td>クレア化学研究所</td><td> DR46B </td><td>ステップB、6.8 </td></tr><tr><td>デジタル超音波処理細胞攪乱</td><td>ブランソン</td><td> 450D-0101063591 </td><td> 、4.3ステップ</td></tr><tr><td> DynaMag-2磁石（磁性粒子コンセントレータ） </td><td>インビトロジェン</td><td> 123-21D </td><td>洗浄工程のすべての磁気ビーズのために、7.5.1ステップBステップ</td></tr><tr><td> DynaMag-15マグネット（磁気粒子コンセントレータ） </td><td>インビトロジェン</td><td> 123.01D </td><td> 、5とステップ6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR（磁性粒子コンセントレータ） </td><td>インビトロジェン</td><td> 49から2025 </td><td>ステップB、6.5 </td></tr><tr><td> 大腸菌DNAポリメラーゼI </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td>ステップB、5.6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambionの</td><td> AM9516 </TD&gt; <td> 、7.5.1ステップB、4.3および6.5のステップ</td></tr><tr><td>イルミナCBOTクラスタ生成システム</td><td>イルミナ</td><td> SY-301-2002 </td><td>ステップB、7.4 </td></tr><tr><td>イルミナGenome AnalyzerのIIxは</td><td>イルミナ</td><td> SY-301-1301 </td><td>ステップB、7.5 </td></tr><tr><td>イルミナPEプライマー</td><td>イルミナ</td><td> PE-102-1004 </td><td>ステップB、5.4（必要に応じて） </td></tr><tr><td>インテリミキサー</td><td> Palicoバイオ</td><td> RM-2L </td><td>ステップB、回転を持つ任意のインキュベーション</td></tr><tr><td>ライトサイクラー480リアルタイムPCRシステム</td><td>ロシュ社</td><td> 04 640 268 001 </td><td> 、7.5.3ステップBステップ、7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNAのSYBR Green Iマスターミックス</td><td>ロシュ社</td><td> 03 752 186 001 </td><td>ステップB、7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280ストレプトアビジンDynabeads®を</td><td>インビトロジェン</td><td> 11206D </td><td>ステップB、5.2 </td></tr> &lt;TR&gt; <td>磁気（ダイナ）プロテインG </td><td>インビトロジェン</td><td> 100.03D </td><td> 、5.1.1および5.2.1のステップ</td></tr><tr><td>高密度（2ミリリットル）をMaXtract </td><td>キアゲン</td><td> 129056 </td><td> 、7.5.1ステップ</td></tr><tr><td>高密度（50ミリリットル）をMaXtract </td><td>キアゲン</td><td> 129073 </td><td>ステップB、4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td>アーゼONEリボヌクレアーゼ</td><td>プロメガ</td><td> M426C </td><td>ステップB、4.8 </td></tr><tr><td> RNAポリメラーゼII（8WG16）モノクローナル抗体</td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td>ステップ5.2.4 </td></tr><tr><td>オークリッジ遠心管（ポリプロピレン） </td><td>ナルゲン</td><td> 3119-0050 </td><td>ステップ3.1 </td></tr><tr><td>オークリッジ遠心チューブ（テフロンFEP） </td><td>ナルゲン</td><td> 3114-0050 </td><td>ステップB、4.3 </td></tr><tr><td> Phusイオンハイ·フィデリティマスターミックス</td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Bは、ステップ6に</td></tr><tr><td>ピコグリーン（クワント-IT）のdsDNA試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> P11495 </td><td>ステップ7.5.2 </td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底試験管</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352057 </td><td> 4.1ステップ</td></tr><tr><td>プロテアーゼインヒビターカクテル錠（完全、EDTAフリー） </td><td>ロシュ社</td><td> 11873580001 </td><td> 、1.6以降のステップ</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK溶液（20mg/ml） </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> 、4.4、7.5.1ステップ ステップB 4.1 </td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td>ステップB、2.2、3.9および5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ緩衝液（NEB） </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td>ステップB、3.3および3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNAポリメラーゼ</td><td>プロメガ</td><td> M4215 </td><td>ステップB、1.2 </td></tr><tr><td> T4 DNAポリヌクレオチドキナーゼ</td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td>ステップB、3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBSキットV5-GA </td><td>イルミナ</td><td> FC-104-5001 </td><td>イルミナGenome AnalyzerのIIxは、システムのリージェンツ</td></tr><tr><td> TruSeq PEクラスタキットV2-CBOT-GA </td><td>イルミナ</td><td> PE-300-2001 </td><td>イルミナCBOTクラスタ発電システムで使用できるようにするには</td></tr><tr><td> SYBR Green Iを</td><td>インビトロジェン</td><td> S-7585 </td><td>ステップB、6.3および6.8 </td></tr><tr><td> X細胞SureLockミニ細胞電気泳動システム</td><td>インビトロジェン</td><td> EI0001 </td><td>ステップB、6.3および6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td colspan="2"> シーケンス </td><td> コメント </td></tr><tr><td rowspan="2">ビオチン化したハーフリンカーA（200ng/μl） </td><td>トップ</td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AACの3&#39; </td><td> 250ナノモル規模HPLC精製された内部ビオチンDT（9） </td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250ナノモルスケールHPLC精製</td></tr><tr><td rowspan="2">ビオチン化したハーフリンカーB（200ng/μl） </td><td>トップ</td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AACの3&#39; </td><td> 250ナノモル規模HPLC精製された内部ビオチンDT（9） </td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250ナノモルスケールHPLC精製</td></tr><tr><td rowspan="2">非ビオチン化したハーフリンカー（200ng/μl） </td><td>トップ</td><td> 5 &#39;CGC GGC GAT ATC GGA TCC AACの3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20アダプター（200ng/μl） </td><td>トップ</td><td> 5 &#39;CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCC CATCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20アダプターB（200ng/μl） </td><td>トップ</td><td> 5 &#39;CTG C​​AC AGA GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5 &#39;CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT TGT GCG CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td rowspan="2">イルミナ-NNアダプタ</td><td>トップ</td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250ナノモルスケールHPLC精製は、ステップB、5.4を参照してください。 </td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5 &#39;リン - GAT CGG AAG AGC TCA GGT GCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250ナノモルスケールHPLC精製は、5 &#39;末端は、ステップBを参照してください5.4リン酸化</td></tr><tr><td>イルミナ1から454（フォワード）プライマー（10μM） </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td>イルミナ2から454（リバース）プライマー（10μM） </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA CGG GAT TCC ATC TCA TCC CTG C​​GT GTCの3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td>定量PCRプライマー1.1（10μM） </td><td colspan="2"> 5 &#39;→3 AT AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG&#39; </td><td> 10nmole規模PCRグレード</td></tr><tr><td>定量PCRプライマー2.1（10μM） </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole規模PCRグレード</td></tr><tr><td>イルミナの3から454シークエンシングプライマー（100μM） </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT TTC CTG C​​CT CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmoleスケールHPLC精製</td></tr><tr><td>イルミナの4から454の配列決定プライマー（100μM） </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT TGT GCG CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole規模HPLC精製</td></tr></tbody></table>統合されたDNAテクノロジー（IDT）からオリゴおよびアダプタのテーブル。注文オリゴは、10前述と同様にリンカーおよびアダプタを準備します。ハーフリンカーとアダプタあらかじめ準備され、-20℃で数ヶ月の​​保存が可能

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

ゲノムは、ミクロンサイズの核のスペース内に高次のコンフォメーション7、2、12を採用し 、三次元構造に編成されています。このようなアーキテクチャは、ランダムではなく、遺伝子のプロモーターおよび調節エレメント13との間の相互作用を伴う。特定の調節配列に転写因子の結合は、転写調節と協調1、14のネットワークをもたらす。 ペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析は、これらの高次クロマチン構造の5,6を識別するために開発されました。セルが固定されており、相互作用する遺伝子座は、共有結合、DNA-タンパク質のクロスリンクによってキャプチャされます。非固有のノイズを最小限に抑え、複雑さを軽減するだけでなく、クロマチンの相互作用分析の特異性を向上させるために、クロマチン免疫沈降（ChIP）は、近接ライゲーションの前に興味のあるクロマチンの断片を豊かにするために、特定のタンパク質因子に対して使用されている。ハーフリンカーを含むライゲーションは、その後、個々のクロマチン複合体の中で一緒につながれたDNA断片のペアの間に共有リンクを形成します。ハーフリンカーに隣接MmeI制限酵素サイトはMmeI消化時のペアの終了タグ - リンカー - タグ構造（PETS）の抽出を可能にします。ハーフリンカーはビオチン化されているように、これらのPETの構造は、ストレプトアビジン磁気ビーズを用いて精製されています。精製したPETSは、次世代シーケンシング·アダプタとの相互作用フラグメントのカタログのようなイルミナGenome Analyzerなどの次世代シーケンサーを経由して生成されますと連結されています。マッピングおよびバイオインフォマティクス解析は、チップに富む結合部位とチップ濃縮クロマチンの相互作用8を識別するために実行されます。 我々は、チップの品質がCHIA-PETライブラリの結果に大きな役割を果たしている特にCHIA-PETプロトコルは、チップの準備の重要な側面を示すためにビデオを制作しています。プロトコルがあるよう非常に長い、唯一の重要なステップは、ビデオで表示されます。

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Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

ペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用分析のための方法です。<em&gt; de novoの</em転写制御の理解を深めるためのクロマチンの相互作用&gt;検出。

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

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Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...