Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Os autores são apoiados por A * STAR de Cingapura. Além disso, MJF é apoiada por um Nacional ESTRELA A * Bolsa de Ciência, L&#39;Oréal para Mulheres na Ciência Nacional Fellowship e Lee Kuan Yew Sociedade Pós-Doutorado. YR é suportado pelo NIH (R01 Codificar subsídios HG004456-01 e R01 HG003521-01). Os autores também reconhecem a equipe de vídeo de 8 Productions Pixels, de Cingapura, em especial o Sr. Kelvin Issey, Chang Kai Xiang Sr. e Sherwin Mr. Gan para filmar as cenas, a Sra. Siti Rahim para edição de vídeo e Michelle Sra. Teo para o voice-over.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Chia-PET é um método desenvolvido para identificar interações de longo alcance na regulação da transcrição. Um dos factores críticos que determinam a qualidade de uma biblioteca de Chia-PET é a qualidade do material ChIP. O protocolo mostrado no vídeo incorpora o uso de EGS e formaldeído para reticular as células. A utilização de formaldeído combinado com um reagente de ligação cruzada tendo um segundo braço mais longo espaçador pode ajudar na ligação de proteínas que não podiam ser ligados por formaldeído sozinho 3,11,15. Foram construídas bibliotecas com este método que demonstraram robustos sítios de ligação e de longo alcance das interacções 9. No entanto, a reticulação e das condições de chip deve ser optimizada para cada factor de interesse, e é importante para não sobre-reticulação como demasiada reticulação irá resultar em dificuldades de fragmentação por sonicação, e pode possivelmente resultar em interacções de cromatina espúrios . Interações de cromatinaidentificado por Chia-PET deve ser validado por um método diferente, tais como hibridação in-situ de fluorescência 4. Recomendamos um mínimo de 100 ng de material de cromatina. Embora tenhamos construído bibliotecas de boa qualidade a partir de 50 ng de material de cromatina, observou-se que grandes quantidades de material de partida permitiu a construção de bibliotecas de Chia-PET com menos de 16 ciclos de PCR, amplicons, minimizando assim e redundância de cada biblioteca. Esta menor redundância correlacionada com a maior únicas marcas mapeadas e também uma alta porcentagem de dados úteis, permitindo assim um mapa de interação mais abrangente cromatina com pistas menos de seqüenciamento. O volume final embalado de grânulos em cada tubo deve ser de 50 uL e 100 uL de pérolas magnéticas e Sepharose respectivamente. Se o volume embalado grânulo é menos do que o indicado, para trazer o volume mínimo embalado com similarmente pré-limpos em branco esferas magnéticas ou Sepharose para minimizar a perda de DNA-rolamento de esferass nas etapas subseqüentes. Cano serrado dicas ou grande-core dicas devem ser usadas para pipetagem contas Sepharose. As modificações que se seguem foram incorporados na sequência do publicado anteriormente Chia-PET protocolo 5. Em primeiro lugar, as esferas magnéticas g foram utilizados para minimizar a perda de amostra durante as lavagens. Além disso, identificou-se as bandas não específicas com tamanhos aproximados de 100 pb e 138 pb para ser amplicões de auto-ligadura meias-linkers e / ou adaptadores. Assim, nós reduziu a concentração de biotinilados meias-linkers e 454 GS20 adaptadores para minimizar as bandas não específicas durante a amplificação por PCR. O volume ligadura proximidade foi reduzida de 50 ml a 10 ml para minimizar a perda de amostra durante os passos de purificação subsequentes e também economizar nos custos de reagentes. Nós também aumentou o tempo de incubação para imobilizar Chia-PET DNA para grânulos para garantir a captura máxima de Chia-PET ADN sobre as pérolas de estreptavidina. Durante o passo de ligação proximidade, ligaduras quiméricos that não representam verdadeira de interacções in vivo de cromatina são inevitavelmente gerado de uma forma não-específica e aleatórios. Assim, para avaliar a qualidade dos dados a partir de qualquer experiência Chia-PET, a taxa de quimerismo é estimado a partir da utilização de dois diferentes meias-linkers com específica de nucleótidos códigos de barras e TAAG ATGT 5. Depois de alto rendimento sequenciação, as sequências de Chia-PET são primeiro analisado para uma composição de código de barras linker e sequências derivadas de produtos de ligação específicos e produtos não específicos de ligação podem ser distinguidos 8. A percentagem de quimeras conhecidos (isto é, ligantes heterodímeros AB) apresentam no nosso em casa MCF-7 a RNA polimerase II Chia-PET bibliotecas é menos do que 15%. Chia-PET sequências são posteriormente classificadas em duas categorias, a saber, auto-ligadura os animais de estimação e laqueadura inter-PETS. Auto-ligação TAP são obtidos a partir de auto-circularização ligadura dos fragmentos de cromatina, enquanto a ligadura inter-TAP são derivados a partir de inter ligadura entre dois fragmentos de DNA diferentes. Este último é, então, sub-divididos em três categorias diferentes com base na distância genômico de cada tag no mesmo cromossomo (intracromossômica ligadura inter-PET) ou que ambas as marcas são mapeados para dois cromossomos diferentes (intercromossômicas ligadura inter-PET). Nós desenvolvemos um Chia-PET pacote de software ferramenta para classificar as diferentes categorias 8. Isto será baseado nos fragmentos de ADN que estão na biblioteca. Geralmente, os fragmentos menores chip vai dar uma maior resolução e cortado o para estes RNA polimerase II Chia-PET bibliotecas é de cerca de 4 kb. Além disso, as interacções de cromatina reais pode ser distinguida de ruído aleatório por contagem do número de ligadura inter-TAP em um cluster de interacção, por outras palavras, um aglomerado de contagem de PET de alta diz-se ter uma maior probabilidade de ser uma interacção real, 8 cromatina . Para filtrar os falsos positivos umsubir de âncoras altamente enriquecido, que pode formar a ligadura inter-PETs por acaso, um quadro de análise estatística também foi formulada para explicar a formação aleatória de algum animal de estimação de ligação inter-entre duas âncoras 8. Em conclusão, a técnica Chia-PET permite o mapeamento de redes de interação de cromatina em uma escala global. A implementação de ChIP em Chia-PET permite a redução da complexidade da biblioteca e ruído de fundo. Além disso, adiciona ChIP especificidade para as interacções de cromatina, permitindo o exame das interacções de cromatina específicos associados com factores de transcrição específicos 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 4-20% gradiente de TBE gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> Passo B, 6,3 </td></tr><tr><td> 5 x tampão ligase T4 DNA com PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> Passo B, 2,2 </td></tr><tr><td> 6% de gel de TBE </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> Passo B, 6,8 </td></tr><tr><td> Agilent DNA 100 Ensaio </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> Passo B, 7,1 </td></tr><tr><td> Agilent Ensaio DNA de alta sensibilidade </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> Centrifugar Filtros Tubo (Spin-X) </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Passo B, 3,7 e 6,9 </td></tr><tr><td> Transilluminator Leitor escuro </td><td> Clare Chemical Research </td><td> DR46B </td><td> Passo B, 6,8 </td></tr><tr><td> Digital Celular Sonifier Disrupter </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> Passo A, 4,3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 ímã (Concentrador de Partículas Magnéticas) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Passo A, Passo B 7.5.1, para todos os passos de lavagem esferas magnéticas </td></tr><tr><td> DynaMag-15 Ímã (Concentrador de Partículas Magnéticas) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> Passo A, 5 e 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (Concentrador de Partículas Magnéticas) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> Passo B, 6,5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli DNA Polimerase I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> Passo B, 5,6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> Passo A, Passo B 7.5.1, 4,3 e 6,5 </td></tr><tr><td> Illumina CBOT Sistema de Geração de Cluster </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> Passo B, 7,4 </td></tr><tr><td> Illumina Genome Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> Passo B, 7,5 </td></tr><tr><td> Illumina PE primers </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Passo B, 5,4 (se necessário) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico Biotech </td><td> RM-2L </td><td> Passo B, quaisquer incubações com rotação </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR System </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> Passo A, Passo B 7.5.3, 7,3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Etapa B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Estreptavidina Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> Passo B, 5,2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Magnética (Dynabeads) Proteína G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> Etapa A, 5.1.1 e 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract de Alta Densidade (2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> Passo A 7.5.1, </td></tr><tr><td> MaXtract de Alta Densidade (50 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> Passo B, 4,2 </td></tr><tr><td> CEMm </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNase Ribonuclease ONE </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> Passo B, 4,8 </td></tr><tr><td> RNA polimerase II (8WG16) anticorpo monoclonal </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> Passo A, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Tubos da centrífuga (polipropileno) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> Passo A, 3,1 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Tubos da centrífuga (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> Passo B, 4,3 </td></tr><tr><td> Phusion Alta Fidelidade Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Passo B, 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (Quant-iT) Reagente dsDNA </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> Passo A, 7.5.2 </td></tr><tr><td> Poliestireno Tubo de Ensaio de fundo redondo </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> Passo A, 4,1 </td></tr><tr><td> Inibidor da Protease Comprimidos Cocktail (completo, EDTA-free) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Etapa A, 1.6 em diante </td></tr><tr><td> Proteinase K Solução (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> Passo A, 4,4, 7.5.1 Passo B, 4,1 </td></tr><tr><td> DNA-ligase de T4 </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Passo B, 2,2, 3,9 e 5,4 </td></tr><tr><td> T4 DNA Ligase Buffer (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Passo B, 3,3 e 3,9 </td></tr><tr><td> DNA polimerase de T4 </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>Passo B, 1,2 </td></tr><tr><td> Quinase de polinucleótido T4 DNA </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> Passo B, 3,3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Kit v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Regentes para Illumina Genome Analyzer IIx sistema </td></tr><tr><td> TruSeq PE Cluster Kit v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> para ser usado com Illumina Sistema de Geração de Cluster CBOT </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Etapa B, 6,3 e 6,8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Sistema de Electroforese Mini-Cell </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Etapa B, 6,3 e 6,8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td colspan="2"> Seqüência </td><td> Comentários </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinilado meias-linkers A (200ng/μl) </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 escala nmole HPLC purificada Interna Biotina dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;TTG GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole HPLC escala purificada </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinilado meias-linkers B (200ng/μl) </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 escala nmole HPLC purificada Interna Biotina dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATG GGA GTT TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole HPLC escala purificada </td></tr><tr><td rowspan="2"> Não biotinilado meias-linkers (200ng/μl) </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;TTG GGA TCC ATC GAT GC 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptor A (200ng/μl) </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;TCT CCA CAT CCC TGC GTG CAT TCCCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA GGA GGG AAC CAG AGA TGG CAG GAC ACG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptador B (200ng/μl) </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;GCA CTG AGA CAC ACA AGG GGG GAT CAA GGC CAG ACA GG GGG ATA 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATC CCT CCC TGT GTG TGC CCT CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN adaptadores </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;CTC TTT ACA ACG CCC TAC ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmole escala purificada por HPLC Veja Etapa B, 5,4 </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;fosfato - GAT CGG GGT AAG AGC TCA ACG GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 nmole escala purificada por HPLC fosforilada 5 &#39;Veja Etapa B, 5,4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (frente) primer (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;ACG AAT GAT GCG ACC ACC ACC GAG ATC TAC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 primer (reverso) (10 mM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA ACG GAA GAC GGC ATA CGA CGG GAT ATC TCC ACT TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1,1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;ACG AAT GAT GCG GAG ACC ACC AT 3&#39; </td><td> 10nmole escala PCR Grau </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2,1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA ACG GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole escala PCR Grau </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 iniciador de sequenciação (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG CAT TCC CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole CLAE em escala purificada </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 iniciador de sequenciação (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT CTA TGC GTT GCG TCC CCT TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> Escala 100nmoleHPLC purificada </td></tr></tbody></table> Oligos Tabela de oligos e adaptadores. Pedido de DNA integrado Technologies (IDT) e preparar linkers e adaptadores da mesma maneira como descrito anteriormente 10. Meia-linkers e adaptadores podem ser preparados de antemão e armazenados durante vários meses a -20 ° C.

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

Genomas são organizadas em estruturas tridimensionais, que adopta conformações de ordem mais elevada no interior dos espaços micron de tamanho nucleares 7, 2, 12. Tais arquiteturas não são aleatórias e envolvem interações entre genes promotores e elementos regulatórios 13. A ligação de fatores de transcrição específicos para seqüências regulatórias traz uma rede de regulação da transcrição e coordenação 1, 14. Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) foi desenvolvido para identificar estas estruturas de ordem superior de cromatina 5,6. As células são fixadas e loci que interagem entre são capturados por covalentes DNA-proteína ligações cruzadas. Para minimizar o ruído não-específica e reduzir a complexidade, bem como para aumentar a especificidade da interacção análise da cromatina, cromatina imunoprecipitação (ChIP) é usada contra factores proteicos específicos para enriquecer fragmentos de cromatina de interesse antes da ligadura proximidade. Ligadura envolvendo meias-linkers subsequentemente forma ligações covalentes entre os pares de fragmentos de DNA amarrados em conjunto dentro de complexos de cromatina individuais. Os sítios de restrição flanqueando CEMm enzimas nas meias-linkers permitir a extração de pares finais tag-tag-linker construções (PETS) sobre a digestão CEMm. À medida que os ligantes são meias-biotinilado, essas construções de PET são purificados utilizando estreptavidina-magnéticos grânulos. Os PETs purificados são ligados com adaptadores de seqüenciamento da próxima geração e um catálogo de fragmentos de interação é gerada através de próxima geração de sequenciadores como o Analyzer Genoma Illumina. Mapeamento e análise bioinformática é então realizada para identificar ChIP enriquecido locais de ligação e as interações ChIP enriquecidos com cromatina 8. Produzimos um vídeo para demonstrar aspectos críticos do protocolo Chia-PET, especialmente a preparação de ChIP como a qualidade do ChIP desempenha um papel importante no resultado de uma biblioteca de Chia-PET. À medida que os protocolos sãomuito longo, apenas os passos críticos são mostrados no vídeo.

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Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) é um método para<em&gt; De novo</em&gt; Detecção de interações de cromatina, para melhor entendimento do controle da transcrição.

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

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Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...