Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Авторы поддерживают A * STAR в Сингапуре. Кроме того, MJF поддерживает A * STAR Национальный научный стипендии L&#39;Oreal для женщин в науке Национального стипендий и Ли Куан Ю пост-докторские стипендии. YR поддерживается грантами NIH КОДИРОВАНИЯ (R01 HG004456-01 и R01 HG003521-01). Кроме того, авторы признают, видеосъемка команда из 8 пикселей Productions, Сингапур, в частности, г-н Иссей Кельвина, г-н Чан Кай Сян и г-н Ган Sherwin для съемок сцены, г-жа Сити Рахим для редактирования видео и г-жа Мишель Teo для голос за кадром.

<ol>
	<li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB1+packages+densely+looped,+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes.">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li><li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+replication+and+transcription.">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li><li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states.">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li><li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei.">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li><li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing.">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22 (2010).</li><li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation.">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li><li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis.">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12 (2007).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li><li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+at+a+distance:+DNA-looping+and+initiation+of+transcription.">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li><li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Чиа-ПЭТ является метод, разработанный для определения дальних взаимодействий в регуляции транскрипции. Одним из важнейших факторов, определяющих качество Чиа-ПЭТ библиотека качество стружки. Протокол показано в видео включает в себя использование ЭТУ и формальдегида перекрестной ссылки клеток. Использование формальдегида в сочетании со вторым сшивания реагент несущие больше Spacer руке может помочь в связывании белков, которые не могут быть связаны только формальдегид 3,11,15. Мы построили библиотеки с помощью этого метода, которые продемонстрировали надежные сайты связывания и дальнодействия 9. Тем не менее, сшивания и чип условия должны быть оптимизированы для каждого фактора интересов, и важно не переусердствовать, сшивания, как слишком много перекрестных связей приведет к трудностям в фрагментации с помощью ультразвука, и, возможно, привести к ложным взаимодействия хроматина . Хроматина взаимодействияопределенных Чиа-ПЭТ должны быть проверены другим методом, например, флуоресценции в гибридизация 4. Мы рекомендуем, как минимум, 100 нг хроматина материала. В то время мы построили хорошие библиотеки качества от 50 нг хроматина материал, мы обнаружили, что большое количество исходного материала позволило строительства Чиа-ПЭТ библиотеки менее 16 циклов ПЦР, тем самым минимизируя ампликонов и избыточности каждой библиотеки. Это ниже избыточности связаны с более высокой уникальный отображаются теги, а также высокий процент полезных данных, что позволяет более полной карты хроматина взаимодействие с меньшим количеством полос последовательности. Окончательный объем упакованных шариков в каждой пробирке должна быть 50 мкл и 100 мкл для магнитных и сефарозы бусины соответственно. Если упакованные шарик объем меньше, чем указано, довести до минимального объема груза в упаковке с аналогичным предварительно очищены пустые магнитных или сефароза бисером, чтобы минимизировать потери ДНК-шарик подшипникас в последующих шагах. Обрезов советы больших основные советы должны быть использованы для пипетки сефарозы бисера. Следующие изменения были внесены в соответствии с ранее опубликованным Чиа-ПЭТ протокол 5. Во-первых, магнитные шарики G были использованы для минимизации потерь в образце стирок. Кроме того, мы выявили неспецифические группы с примерными размерами 100 б.п. и 138 б.п., что ампликонов собственного перевязанной половины линкеры и / или адаптеров. Таким образом, мы уменьшили концентрацию биотинилированного половины линкеры и 454 GS20 адаптеры для минимизации неспецифической полосы во время ПЦР-амплификации. Объем близости перевязка была снижена с 50 мл до 10 мл, чтобы минимизировать потери образца во время последующих стадий очистки, а также экономить на реагент расходы. Мы также увеличили инкубационный период для иммобилизации Чиа-ПЭТ ДНК бисер для обеспечения максимального захвата Чиа-ПЭТ ДНК на бисер стрептавидином. На этапе непосредственной близости перевязки, перевязки химерных тхат не представляют истинной в естественных условиях взаимодействия хроматина неизбежно генерируется в неспецифических и случайным образом. Таким образом, для оценки качества данных из любой Чиа-ПЭТ эксперимент, скорость химеризма оценивается с использованием двух различных полу-линкеры с конкретными нуклеотидных штрих TAAG и ATGT 5. После высокой пропускной последовательности, Чиа-ПЭТ последовательности сначала анализируется на компоновщик состав штрих-кодов и последовательностей, полученных от определенных продуктов лигирования и неспецифические продукты перевязки можно выделить 8. Процент известных химер (т.е. гетеродимеров AB линкеров), присутствующих в нашей собственной MCF-7 РНК-полимеразы II Чиа-ПЭТ библиотеки составляет менее 15%. Чиа-ПЭТ последовательности впоследствии разделить на две категории, а именно самолигирование животных и меж-перевязка ПЭП. Self-перевязка ПЭП получены от индивидуальной рассылке лигирования фрагментов хроматина в то время как между перевязки домашних животных, полученных от гГюнтер-перевязки между двумя различными фрагментами ДНК. Последний затем подразделяется на три категории в соответствии с геномной расстояние каждой метки на той же хромосоме (внутрихромосомной между перевязки ПЭП) или как теги отображаются на двух разных хромосом (interchromosomal между перевязки ПЭП). Мы разработали Чиа-ПЭТ инструмента программный пакет, чтобы разобраться в различных категориях 8. Это будет основываться на фрагменты ДНК, которые находятся в библиотеке. Как правило, более мелкие фрагменты чип будет давать более высокое разрешение и отрезать эти РНК-полимеразы II Чиа-ПЭТ библиотеки составляет около 4 кб. Кроме того, реальные взаимодействия хроматина можно отличить от случайных шумов путем подсчета количества взаимосвязанных перевязки ПЭП во взаимодействии кластера, другими словами, кластер высокой количество ПЭТ, как говорят, более высокую вероятность быть реальное взаимодействие хроматина 8 . Для фильтрации ложных срабатываний нашеговоскреснуть из обогащенного якорей, которые могут образовывать между перевязки ПЭП по случайности, статистические рамки анализа также были сформулированы для учета случайного формирования любой перевязки между ПЭП между двумя якорями 8. В заключение, Чиа-ПЭТ технология позволяет отображение сети хроматина взаимодействие в глобальном масштабе. Реализация чип Чиа-ПЭТ позволяет снизить сложность и библиотеку фоновых шумов. Кроме того, добавляет ChIP специфичность хроматина взаимодействия, что позволяет при рассмотрении конкретных взаимодействий хроматина, связанные с конкретными факторами транскрипции 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 4-20% градиент TBE геля </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> Шаг B, 6.3 </td></tr><tr><td> 5 х буфера T4 ДНК-лигазы с PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> Шаг B, 2.2 </td></tr><tr><td> 6% TBE геля </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> Шаг B, 6,8 </td></tr><tr><td> Agilent ДНК 100 Анализ </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> Шаг B, 7.1 </td></tr><tr><td> Agilent Высокая чувствительность Анализ ДНК </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent биоанализаторе 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> Одноразовая пробирка фильтры (Spin-X) </td><td> Corning &lt;/ TD&gt; <td> CLS8160 </td><td> Шаг B, 3,7 и 6,9 </td></tr><tr><td> Темные трансиллюминатор чтения </td><td> Клэр химических исследований </td><td> DR46B </td><td> Шаг B, 6,8 </td></tr><tr><td> Цифровой Sonifier Сотовые Disrupter </td><td> Брэнсон </td><td> 450D-0101063591 </td><td> Шаг, 4.3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 магнита (магнитный концентратор частиц) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Шаг, шаг 7.5.1 B, для всех магнитных шариков промывки </td></tr><tr><td> DynaMag-15 Магнит (магнитно-концентратор частиц) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> Шаг, 5 и 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (магнитно-концентратор частиц) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> Шаг B, 6.5 </td></tr><tr><td> Кишечная палочка ДНК-полимеразы I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> Шаг B, 5,6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </TD&gt; <td> Шаг, шаг B 7.5.1, 4.3 и 6.5 </td></tr><tr><td> Illumina CBOT кластера поколение системы </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> Шаг B, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina Genome Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> Шаг B, 7.5 </td></tr><tr><td> Illumina PE грунтовки </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Шаг B, 5.4 (при необходимости) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico Biotech </td><td> RM-2L </td><td> Шаг B, любой инкубации с вращением </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR System </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> Шаг, шаг B 7.5.3, 7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 ДНК SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Шаг B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 стрептавидин Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> Шаг B, 5.2 </td></tr> &lt;TR&gt; <td> Магнитные (Dynabeads) Белок G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> Шаг, 5.1.1 и 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract высокой плотности (2 мл) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> Шаг, 7.5.1 </td></tr><tr><td> MaXtract высокой плотности (50 мл) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> Шаг B, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> РНКазы ONE рибонуклеазы </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> Шаг B, 4.8 </td></tr><tr><td> РНК-полимеразы II (8WG16) моноклональных антител </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> Шаг, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge пробирок (полипропилен) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> Шаг, 3.1 </td></tr><tr><td> Oak Ridge пробирок (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> Шаг B, 4.3 </td></tr><tr><td> Phusионных High Fidelity Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Шаг B, 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (Квант-It) дц реагентов </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> Шаг, 7.5.2 </td></tr><tr><td> Полистирол Круглый пробирке нижний </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> Шаг, 4.1 </td></tr><tr><td> Ингибитор протеазы коктейль таблетки (полный, без ЭДТА) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Шаг, 1,6 года </td></tr><tr><td> Протеиназы К Solution (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> Шаг, 4.4, 7.5.1 Шаг B, 4.1 </td></tr><tr><td> T4 ДНК-лигазы </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Шаг B, 2.2, 3.9 и 5.4 </td></tr><tr><td> Т4 ДНК лигазы буфера (НЭБ) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Шаг B, 3.3 и 3.9 </td></tr><tr><td> T4 ДНК-полимеразы </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>Шаг B, 1.2 </td></tr><tr><td> T4 ДНК-киназы полинуклеотидных </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> Шаг B, 3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Kit v5-ГА </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Регентов для Illumina Genome Analyzer IIx системы </td></tr><tr><td> TruSeq PE кластера Kit v2-CBOT-ГА </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> быть использования с Illumina CBOT системы генерации кластеров </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Шаг B, 6.3 и 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock мини-Cell электрофорез системы </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Шаг B, 6.3 и 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Имя </td><td colspan="2"> Последовательность </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td rowspan="2"> Биотинилированные половины линкеры (200ng/μl) </td><td> Топ </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / УВД TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 нмоль масштабе ВЭЖХ Очищенный внутренних Биотин DT (9) </td></tr><tr><td> Бот </td><td> 5 &#39;GTT GGA ТАА GAT УВД GC 3&#39; </td><td> 250 нмоль масштабе очищенную ВЭЖХ </td></tr><tr><td rowspan="2"> Биотинилированные половины линкеров B (200ng/μl) </td><td> Топ </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 нмоль масштабе ВЭЖХ Очищенный внутренних Биотин DT (9) </td></tr><tr><td> Бот </td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG ТАТ УВД GC 3&#39; </td><td> 250 нмоль масштабе очищенную ВЭЖХ </td></tr><tr><td rowspan="2"> Номера биотинилированного половины линкеры (200ng/μl) </td><td> Топ </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT УВД GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 нмоль масштабе ПЦР класса </td></tr><tr><td> Бот </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT УВД GC 3&#39; </td><td> 250 нмоль масштабе ПЦР класса </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 адаптер (200ng/μl) </td><td> Топ </td><td> 5 &#39;ОСО TCT CAT CCC ТГК GTG TCC CATCTG ТТК CCT CCC TGT СТС AGN N 3 &quot; </td><td> 250 нмоль масштабе ПЦР класса </td></tr><tr><td> Бот </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 нмоль масштабе ПЦР класса </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 адаптер B (200ng/μl) </td><td> Топ </td><td> 5 &#39;КТГ AGA CAC GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC АСА CAG GGG GG ATA 3&#39; </td><td> 250 нмоль масштабе ПЦР класса </td></tr><tr><td> Бот </td><td> 5 &#39;CCT УВД CCC TGT GTG CCT ТГК CTA TCC CCT GTT GCG TGT СТС AGN N 3 &quot; </td><td> 250 нмоль масштабе ПЦР класса </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-НН адаптеры </td><td> Топ </td><td> 5 &#39;ACA СТС ТТТ CCC TAC ACG ACG СТС TTC CGA TC 3 &quot; </td><td> 250 нмоль масштабе ВЭЖХ очищенный см. Шаг B, 5.4 </td></tr><tr><td> Бот </td><td> 5 &#39;фосфора - GAT CGG AAG AGC ГГТ TCA GCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 нмоль масштабе ВЭЖХ очищенный фосфорилирован 5 &#39;конце см. Шаг B, 5.4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (вперед) праймер (10 мкМ) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG УВД TAC ACC CTA TCC CCT GTG ТГК СТТ G 3 &quot; </td><td> 250 нмоль масштабе ПЦР класса </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (реверс) грунтовка (10 мкм) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA ГАА GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC УВД TCA TCC КТГ ВКТ GTC 3&#39; </td><td> 250 нмоль масштабе ПЦР класса </td></tr><tr><td> КПЦР Primer 1.1 (10 мкМ) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG AT 3&#39; </td><td> 10nmole масштабе ПЦР класса </td></tr><tr><td> КПЦР Primer 2.1 (10 мкМ) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA ГАА GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole масштабе ПЦР класса </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 последовательности праймера (100 мкм) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG ТТК CCT CCC TGT СТС AG 3 &#39; </td><td> 100nmole масштабе очищенную ВЭЖХ </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 последовательности праймера (100 мкм) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT ТГК CTA TCC CCT GTT GCG TGT СТС AG 3 &#39; </td><td> 100nmole масштабаОчищенный ВЭЖХ </td></tr></tbody></table> Таблица олигонуклеотидов и адаптеров. Порядке олигонуклеотидов из Комплексная ДНК технологий (IDT) и подготовить линкеры и адаптеры таким же образом, как описано выше 10. Half-сборщики и адаптеры могут быть подготовлены заранее и хранить в течение нескольких месяцев при температуре -20 ° C.

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

Геномы организованы в трехмерную структуру, приняв более высокого порядка конформации в микронных размеров ядерных пространствах 7, 2, 12. Такая архитектура не являются случайными и связаны с взаимодействием между геном промоутеров и регуляторных элементов 13. Связывания транскрипционных факторов в конкретных регуляторных последовательностей приводит к сети регуляции транскрипции и координация 1, 14. Взаимодействие хроматина Анализ Двойное-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) был разработан с целью выявления этих структур высшего порядка 5,6 хроматина. Клетки являются фиксированными и взаимодействующих локусов захвачен ковалентные ДНК-белковых сшивок. Для минимизации неспецифической шума и уменьшения сложности, а также для увеличения специфичности хроматина анализ взаимодействия хроматин иммунопреципитации (чип) используются против определенных белковых факторов обогатить хроматина фрагменты интересов перед близостью перевязка. Лигирование с участием половины линкеры впоследствии образуют ковалентные связи между парами фрагментов ДНК привязаны вместе в отдельных комплексов хроматина. Фланговые ограничения MmeI фермент сайтов в половине линкеры позволяют добычи парный закрывающий тег-линкер-теги конструкций (ПЭП) на пищеварение MmeI. В половине линкеры биотинилированный эти ПЭТ Конструкции очищают, используя стрептавидином магнитных шариков. Очищенный ПЭП лигируют со следующим поколением последовательности адаптеры и каталог взаимодействующих фрагментов генерируется с помощью нового поколения секвенсоров, таких как анализатор Illumina геноме. Сопоставление и анализ биоинформатики Затем проводится для выявления ChIP обогащенные участки связывания и чип-обогащенного хроматина взаимодействия 8. Мы подготовили видео, чтобы продемонстрировать важнейшие аспекты Чиа-ПЭТ протокола, в частности, подготовка чип качество ChIP играет важную роль в исходе Чиа-ПЭТ библиотеки. Поскольку протоколыочень долго, только критические шаги показаны на видео.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Взаимодействие хроматина Анализ Двойное-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) является методом<em&gt; De Novo</em&gt; Обнаружение хроматина взаимодействия, для лучшего понимания контроля транскрипции.

Хроматина анализ взаимодействия с парными-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) для карт хроматина Взаимодействие и понимание регуляции транскрипции

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Хроматин Пробирной по правам ткани мозга

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Хроматин Иммунопреципитация из человеческих эмбриональных стволовых клеток

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Одноместный Читайте и парные Конец мРНК-Seq Illumina библиотек из 10 нанограмм Всего РНК

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Хроматин иммунопреципитации (чип) использование Drosophila Ткани

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Генерация высших шаблона ДНК хроматина Качество Иммунопреципитация для высокопроизводительного секвенирования (чип-след)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Генерация и очистка человека INO80 хроматина комплексов и подкомплексов

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Биохимические анализы для анализа деятельности АТФ-зависимых ферментов хроматина

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Хроматина иммунопреципитации для идентификации Arabidopsis взаимодействий белок-ДНК<em&gt; В Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Выделение конкретных областей генома и идентификации Associated молекул enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...