Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Los autores se apoyan en A * STAR de Singapur. Además, MJF con el apoyo de una beca de A * Star Nacional de Ciencias, un L&#39;Oreal For Women in Science Nacional de Becas y Lee Kuan Yew beca post-doctoral. YR es apoyado por el NIH subvenciones ENCODE (R01 HG004456-01 y R01 HG003521-01). Los autores también agradecen al equipo de la videografía de 8 píxeles Producciones, Singapur, en particular Issey señor Kelvin, el Sr. Chang Kai Xiang y el Sr. Sherwin Gan para el rodaje de las escenas, la Sra. Siti Rahim para edición de vídeo y la Sra. Michelle Teo para la voz en off.

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No hay conflictos de interés declarado.

CHIA-PET es un método desarrollado para identificar interacciones de largo alcance en la regulación de la transcripción. Uno de los factores críticos que determinan la calidad de una biblioteca de Chia-PET es la calidad del material de chip. El protocolo se muestra en el vídeo incorpora el uso de BSA y formaldehído para reticular las células. El uso de formaldehído combinado con un segundo reactivo reticulante teniendo un brazo espaciador más largo puede ayudar en la unión de proteínas que no podían ser obligados por formaldehído solo 3,11,15. Hemos construido bibliotecas con este método que han demostrado fuertes puntos de unión y las interacciones de largo alcance 9. Sin embargo, la reticulación y las condiciones de chip debe ser optimizado para cada factor de interés, y es importante no sobre-reticulación como demasiado reticulación se traducirá en dificultades en la fragmentación por sonicación, y pueden dar lugar a interacciones cromatina espurias . Interacciones de la cromatinaidentificados por Chia-PET deben ser validados por un método diferente, como fluorescencia de hibridación in situ 4. Se recomienda un mínimo de 100 ng de material de la cromatina. Si bien hemos construido bibliotecas de buena calidad a partir de 50 ng de material de la cromatina, hemos observado que grandes cantidades de material de partida permite la construcción de Chia-PET bibliotecas con menos de 16 ciclos de PCR, los amplicones reduciendo así al mínimo y la redundancia de cada biblioteca. Esta redundancia menor correlación con altos etiquetas únicas asignadas y también un alto porcentaje de datos utilizables, lo que permite un mapa de la cromatina interacción más amplia con menos carriles de la secuenciación. El volumen final llena de perlas en cada tubo debe ser de 50 l l y 100 para partículas magnéticas y Sepharose respectivamente. Si el volumen de grano lleno es menos que la indicada, llevar a volumen mínimo lleno de perlas magnéticas o Sepharose igualmente pre-aprobados en blanco para minimizar la pérdida de cordón del ADN de soportes en pasos posteriores. Recortada consejo o consejos a gran núcleo debe utilizarse para pipetear Sefarosa. Las siguientes modificaciones se incorporaron después de la previamente publicada CHIA-PET protocolo 5. En primer lugar, perlas magnéticas G se utiliza para minimizar la pérdida de muestra durante lavados. Además, hemos identificado no específicos bandas con tamaños aproximados de 100 pb y 138 pb para ser amplificados de auto-ligó medias enlazadores o / y adaptadores. Por lo tanto, reduce la concentración de biotina medias conectores y adaptadores de 454 GS20 para reducir al mínimo no específicos de las bandas durante la amplificación por PCR. El volumen de ligación proximidad se redujo de 50 ml a 10 ml a minimizar la pérdida de muestra durante las etapas de purificación posteriores y también ahorrar costos de reactivos. También aumentó el tiempo de incubación para inmovilizar CHIA-PET de ADN a los granos para asegurar la captura máxima de Chia-PET de ADN en las cuentas de estreptavidina. Durante el paso de la ligadura de la proximidad, la ligadura de quiméricos that no representan verdadero in vivo interacciones cromatina están inevitablemente generados de una manera no específica y al azar. Por lo tanto, para evaluar la calidad de los datos de cualquier experimento CHIA-PET, la tasa de quimerismo se estima a partir del uso de dos diferentes medias enlazadores con específica de nucleótidos TAAG códigos de barras y ATGT 5. Después de secuenciación de alto rendimiento, las secuencias CHIA-PET se analizó en primer lugar para la composición de código de barras enlazador y secuencias derivadas de productos de ligación específicas y no específicas productos de ligación se pueden distinguir 8. El porcentaje de quimeras conocidos (es decir, heterodímeros AB enlazadores) presentes en nuestro propio MCF-7 RNA polimerasa II CHIA-PET bibliotecas es inferior al 15%. CHIA-PET secuencias posteriormente se clasifican en dos categorías, a saber, la ligadura de auto Animales domésticos y mascotas entre la ligadura. La ligadura de auto-PET se obtienen de la ligadura de auto-circularización de los fragmentos de cromatina, mientras que entre la ligadura de PET se obtienen a partir de inter-ligación entre dos fragmentos de ADN diferentes. Este último es entonces subdividido en tres categorías diferentes en función de la distancia genómica de cada etiqueta en el mismo cromosoma (intracromosomal entre la ligadura de PET), o que ambas etiquetas se asignan a los dos cromosomas diferentes (interchromosomal entre la ligadura de PET). Hemos desarrollado un paquete de herramientas CHIA-PET de software para resolver las diferentes categorías 8. Esto se basa en los fragmentos de ADN que están en la biblioteca. En general, los fragmentos más pequeños de chip dará una resolución más alta y el corte de estos RNA polimerasa II CHIA-PET bibliotecas es de aproximadamente 4 kb. Además, las interacciones reales de la cromatina se puede distinguir de ruido aleatorio, contando el número de mascotas entre la ligadura en un clúster de la interacción, es decir, un grupo de recuento de PET de alto se dice que tienen una mayor probabilidad de ser una interacción real de la cromatina 8 . Para filtrar los falsos positivos unalevantarse de anclajes altamente enriquecido que pueden formar entre la ligadura de PET por azar, un marco de análisis estadístico también ha sido formulado para dar cuenta de la formación aleatoria de las mascotas entre la ligadura entre las dos anclas 8. En conclusión, la técnica de Chia-PET permite el mapeo de las redes de interacción de la cromatina en una escala global. La implementación de chip en CHIA-PET permite la reducción de la complejidad de la biblioteca y el ruido de fondo. Además, chip añade especificidad a las interacciones cromatina, permitiendo el examen de las interacciones cromatina específicos asociados con factores de transcripción particulares 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 4-20% de gel de gradiente de TBE </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> Etapa B, 6,3 </td></tr><tr><td> 5 x tampón de ligasa T4 DNA con PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> Etapa B, 2,2 </td></tr><tr><td> 6% de gel de TBE </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> Etapa B, 6,8 </td></tr><tr><td> Agilent DNA 100 Ensayo </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> Etapa B, 7,1 </td></tr><tr><td> Agilent de alta sensibilidad para análisis de ADN </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> Centrifugar filtros de tubo (Spin-X) </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Etapa B, 3,7 y 6,9 </td></tr><tr><td> Transiluminador Reader Oscuro </td><td> Clara de Investigaciones Químicas </td><td> DR46B </td><td> Etapa B, 6,8 </td></tr><tr><td> Digital Sonifier disruptor celular </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> Etapa A, 4,3 </td></tr><tr><td> Dynamag-2 imán (concentrador de partículas magnéticas) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Etapa A, B 7.5.1 Paso, para todas las perlas magnéticas de lavado pasos </td></tr><tr><td> Dynamag-15 Imán (concentrador de partículas magnéticas) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> Etapa A, 5 y 6 </td></tr><tr><td> Dynamag-PCR (concentrador de partículas magnéticas) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> Etapa B, 6,5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli ADN polimerasa I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> Etapa B, 5,6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> Etapa A, 7.5.1 Etapa B, 4,3 y 6,5 </td></tr><tr><td> Illumina Cluster CBOT generación del sistema </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> Etapa B, 7,4 </td></tr><tr><td> Illumina Genoma Analizador IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> Etapa B, 7,5 </td></tr><tr><td> Illumina PE cebadores </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Etapa B, 5,4 (si es necesario) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico Biotech </td><td> RM-2L </td><td> Etapa B, cualquier incubaciones con rotación </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR System </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> Etapa A, B Paso 7.5.3, 7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 ADN SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Etapa B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 estreptavidina Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> Etapa B, 5,2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Magnética (Dynabeads) Proteína G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> Etapa A, 5.1.1 y 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract de alta densidad (2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> Etapa A 7.5.1, </td></tr><tr><td> MaXtract de alta densidad (50 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> Etapa B, 4,2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNasa ONE ribonucleasa </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> Etapa B, 4,8 </td></tr><tr><td> ARN polimerasa II (8WG16) anticuerpo monoclonal </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> Etapa A, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge (Tubos de centrífuga de polipropileno) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> Etapa A, 3,1 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Tubos de centrífuga (Teflón FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> Etapa B, 4,3 </td></tr><tr><td> UBSde iones de alta fidelidad de Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Etapa B, 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (Quant-iT) Reactivo de ADN de doble cadena </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> Etapa A, 7.5.2 </td></tr><tr><td> El poliestireno de fondo redondo de tubo de ensayo </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> Etapa A, 4,1 </td></tr><tr><td> Inhibidor de la proteasa cóctel comprimidos (completa, sin EDTA) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Etapa A, 1.6 en adelante </td></tr><tr><td> Proteinasa K de la solución (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> Etapa A, 4,4, 7.5.1 Etapa B, 4,1 </td></tr><tr><td> T4 ADN ligasa </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Etapa B, 2,2, 3,9 y 5,4 </td></tr><tr><td> T4 DNA ligase Buffer (ORC) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Etapa B, 3,3 y 3,9 </td></tr><tr><td> Polimerasa de ADN de T4 </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>Etapa B, 1,2 </td></tr><tr><td> ADN de T4 polinucleótido quinasa </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> Etapa B, 3,3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Kit v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Regentes de Illumina Genoma Analizador IIx sistema de </td></tr><tr><td> TruSeq PE Cluster Kit v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> para utilizar con Illumina Sistema de Generación de CBOT Cluster </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Etapa B, 6,3 y 6,8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell Sistema de Electroforesis </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Etapa B, 6,3 y 6,8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td colspan="2"> Secuencia </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinilado medias enlazadores A (200ng/μl) </td><td> Superior </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATV TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de HPLC purificada interna biotina dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;TTG AGG ATC GAT TAA GC 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de HPLC purificada </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinilado medias enlazadores B (200ng/μl) </td><td> Superior </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de HPLC purificada interna biotina dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;TTG AGG ATC ATG TAT GC 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de HPLC purificada </td></tr><tr><td rowspan="2"> No biotina medias enlazadores (200ng/μl) </td><td> Superior </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT GGA TCC AAC ATC 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de PCR Grado </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de PCR Grado </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptador A (200ng/μl) </td><td> Superior </td><td> 5 &#39;CAT CCA CCC TCT GTG TCC TGC CATCTG CCT TTC CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmol escala de PCR Grado </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA GGA GGG CAG AAC GAC TGG AGA ACG CAG TGA GGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 nmol escala de PCR Grado </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptador B (200ng/μl) </td><td> Superior </td><td> 5 &#39;CTG AGA CAC ACA GGG GCA GAT AGG CAA GGC CAG ACA GGG GG ATA 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de PCR Grado </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;CCT ATC CCC TGT GTG TCC TGC CCT CTA TCC GTT GCG CTC TGT AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de PCR Grado </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN adaptadores </td><td> Superior </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de HPLC purificado Consulte el paso b, 5,4 </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;fosfato - TAG CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de HPLC purificado fosforilada extremo 5 &#39;Ver la Etapa B, 5,4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (hacia adelante) primer (10 mM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT TAG ACG GCG GAG ACC ATC TAC ACC CTA TCC TGC CCT GTG CTT G 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de PCR Grado </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (inversa) de imprimación (10 micras) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GAA ACG GAC GGC ATA GAT CGA CGG TCC TCC CTG TCA ATC CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmol escala de PCR Grado </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1,1 (10 M) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT TAG ACG GCG GAG ACC en 3&#39; </td><td> 10nmole escala de PCR Grado </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2,1 (10 M) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GAA ACG GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole escala de PCR Grado </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 cebador de secuenciación (100 M) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG CCT TTC CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole escala de HPLC purificada </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 cebador de secuenciación (100 M) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG TGC CCT CTA TCC GTT CCT GCG CTC TGT AG 3 &#39; </td><td> Escala 100nmoleHPLC purificada </td></tr></tbody></table> Oligos Tabla de oligos y adaptadores. Orden de Integrated DNA Technologies (IDT) y preparar ligadores y adaptadores de la misma manera como se ha descrito previamente 10. La mitad de los conectores y adaptadores puede ser preparado de antemano y se almacena durante varios meses a -20 ° C.

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

Genomas están organizados en estructuras tridimensionales, la adopción de conformaciones de orden superior dentro de los espacios nucleares del tamaño de micras 7, 2, 12. Arquitecturas de este tipo no son aleatorias e involucran interacciones entre los promotores de genes y elementos reguladores 13. La unión de factores de transcripción específicos a las secuencias reguladoras produce una red de regulación de la transcripción y la coordinación 1, 14. Análisis de la interacción de la cromatina por género Secuenciación Paired-End (Chia-PET) fue desarrollado para identificar las estructuras de la cromatina de orden superior 5,6. Las células se fijan y loci que interactúan son capturados por covalentes ADN-proteína enlaces cruzados. Para minimizar el ruido no específica y reducir la complejidad, así como para aumentar la especificidad del análisis de la interacción de la cromatina, cromatina inmunoprecipitación (chip) se usa contra los factores específicos de la proteína para enriquecer fragmentos de cromatina de interés antes de la ligadura de proximidad. Ligadura de la participación de la mitad de los engarces posteriormente forma enlaces covalentes entre los pares de fragmentos de ADN atados juntos dentro de la cromatina complejos individuales. Los sitios que flanquean MmeI enzimas de restricción en los engarces medio de permitir la extracción de los pares de extremo de la etiqueta-etiqueta enlazador construcciones (PET) sobre la digestión MmeI. Como los enlazadores medio de biotina se, estas construcciones PET se purificó utilizando estreptavidina-magnéticos perlas. Los PET purificados se ligan con los adaptadores de secuenciación de última generación y un catálogo de fragmentos de interacción que se genera a través de la próxima generación de secuenciadores como el analizador del genoma Illumina. Mapeo y análisis de la bioinformática se realiza a continuación para identificar el chip-enriquecida con sitios de unión y enriquecidos con chip-las interacciones de la cromatina 8. Hemos producido un video para demostrar los aspectos críticos del protocolo de Chia-PET, especialmente la preparación de chip como la calidad del chip desempeña un papel importante en el resultado de una biblioteca CHIA-PET. A medida que los protocolos sonmuy largo, sólo los pasos críticos se muestran en el vídeo.

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Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Análisis de la interacción de la cromatina por género Secuenciación Paired-End (Chia-PET) es un método para<em&gt; Novo</em&gt; Detección de las interacciones de la cromatina, para una mejor comprensión del control de la transcripción.

La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

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Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

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The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...