Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Författarna stöds av A * STAR i Singapore. Dessutom MJF stöds av en A * STAR National Science stipendium, en L&#39;Oreal för kvinnor inom vetenskap National gemenskap och en Lee Kuan Yew Post-Doctoral Fellowship. YR stöds av NIH Koda tillskotten R01 HG004456-01 och R01 HG003521-01). Författarna har också erkänt videography team av 8 bildpunkter Productions, Singapore, i synnerhet Mr Kelvin Issey, Mr Chang Kai Xiang och Mr Sherwin Gan för att filma scener, Ms Siti Rahim för videoredigering och Ms Michelle Teo för voice-over.

<ol>
	<li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB1+packages+densely+looped,+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes.">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li><li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+replication+and+transcription.">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li><li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states.">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li><li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei.">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li><li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing.">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22 (2010).</li><li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation.">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li><li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis.">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12 (2007).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li><li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+at+a+distance:+DNA-looping+and+initiation+of+transcription.">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li><li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

CHIA-PET är en metod utvecklats för att identifiera långsiktiga interaktioner i transkriptionsreglering. En av de kritiska faktorerna som bestämmer kvaliteten hos en CHIA-PET-bibliotek är kvaliteten av spånmaterial. Protokollet visat i filmen omfattar användningen av EGS och formaldehyd för att tvärbinda cellerna. Användningen av formaldehyd tillsammans med en andra tvärbindande reagens som bär en längre distansarm kan hjälpa till i bindning av proteiner som inte skulle vara bundna av formaldehyd enbart 3,11,15. Vi har byggt bibliotek med denna metod som har visat robusta bindningsställen och lång räckvidd interaktioner 9. Emellertid kan tvärbindning och CHIP förhållanden bör optimeras för varje faktor av intresse, och det är viktigt att inte över-tvärbindning för mycket tvärbindning kommer att resultera i svårigheter att fragmentering av ultraljudsbehandling, och eventuellt resultera i felaktiga kromatin interaktioner . Kromatin interaktioneridentifieras av Chia-PET skall valideras genom en annan metod, såsom fluorescens in situ hybridisering 4. Vi rekommenderar minst 100 ng kromatin material. Även om vi har konstruerat god kvalitet biblioteken från 50 ng kromatin material, har vi observerat att stora mängder av utgångsmaterial får bygga CHIA-PET bibliotek med mindre än 16 PCR-cykler och därigenom minimera amplikoner och redundans i varje bibliotek. Denna lägre redundans korrelerade med högre mappas unika taggar och också en hög andel av användbara data, vilket möjliggör en mer omfattande karta kromatin interaktion med färre körfält i sekvensering. Den slutliga packad volym av pärlor i varje rör bör vara 50 ^ il och 100 pl för magnetiska och Sepharose-pärlor respektive. Om packade pärlan volymen är mindre än vad som anges, ta den minsta packad volym med liknande förväg rensas tomma magnetiska eller Sepharose pärlor för att minimera förlusten av DNA-bärande pärlas i efterföljande steg. Avsågade spetsar eller stora kärnor tips bör användas för pipettering Sepharose-pärlor. Följande ändringar har införlivats efter tidigare publicerade CHIA-PET protokoll 5. För det första var magnetiska G pärlor används för att minimera provförlust under tvättar. Dessutom identifierade vi icke-specifika band med ungefärliga storlekar av 100 bp och 138 bp vara amplikoner av självligerades halva linkers och / eller adaptrar. Således reduceras vi koncentrationen av biotinylerade halva linkers och 454 GS20 adaptorer för att minimera icke-specifika band under PCR-amplifiering. Närheten Ligeringen reducerades från 50 ml till 10 ml för att minimera provförlust under efterföljande reningssteg och även spara på reagens kostnader. Vi ökade också inkubationstiden för att immobilisera CHIA-PET DNA till pärlor för att säkerställa maximal fångst av CHIA-PET DNA på streptavidinpärloma. Under den närhet ligeringssteget, chimera ligeringar that representerar inte sant in vivo kromatin interaktioner oundvikligen genereras i en icke-specifik och slumpmässigt sätt. Därför, för att utvärdera kvaliteten på de uppgifter från alla CHIA-PET experiment är graden av chimerism beräknas från användningen av två olika halva linkers med särskild nukleotid streckkoder TAAG och ATGT 5. Efter high-throughput sekvensering är Chia-PET-sekvenser analyseras först för linker streckkod komposition och sekvenser som härrör från specifika ligeringsprodukter produkter och icke-specifika produkter ligeringsprodukter kan urskiljas 8. Den procentuella andelen kända chimärer (dvs. heterodimerer AB linkers) som förekommer i vår egen MCF-7 RNA-polymeras II CHIA-PET bibliotek är mindre än 15%. CHIA-PET-sekvenser därefter delas in i två kategorier, nämligen självligering husdjur och inter-ligering husdjur. Självligering teknik erhålls från själva cirkularisering ligering av kromatinet fragmenten, medan inter-ligeringsprodukterna teknik härrör från inter-ligering mellan två olika DNA-fragment. Den senare är då indelad i tre olika kategorier baserat på den genomiska avstånd varje tagg på samma kromosom (intrakromosomal inter-ligeringsprodukterna PET) eller att båda taggarna mappas till två olika kromosomer (interchromosomal inter-ligeringsprodukter PET). Vi har utvecklat en CHIA-PET-paketet verktyg för programvara för att reda ut de olika kategorierna 8. Detta kommer att baseras på de DNA-fragment som finns i biblioteket. I allmänhet kommer mindre CHIP fragment ger en högre upplösning och avskurna för dessa RNA-polymeras II CHIA-PET bibliotek är ca 4 kb. Dessutom kan verkliga kromatin interaktioner särskiljas från slumpmässigt brus genom att räkna antalet inter-ligering teknik i en växelverkan kluster, med andra ord ett kluster av hög PET räkna sägs ha en högre sannolikhet att vara en riktig kromatin samspel 8 . Om du vill filtrera våra falska positiva enöka från höganrikat ankare som kan bilda inter-ligeringsprodukterna husdjur genom slumpen har en statistisk analys ramen även tagits fram för att redovisa för slumpmässig bildande av eventuella tillstötande ligeringsprodukterna teknik mellan två ankare 8. Sammanfattningsvis kan Chia-PET tekniken kartläggning nät kromatin interaktion på en global skala. Genomförande av ChIP i Chia-PET tillåter reduktion av bibliotekets komplexitet och bakgrundsbrus. Dessutom, tillägger ChIP specificitet till kromatin interaktioner, vilket möjliggör granskning av de särskilda kromatin interaktioner i samband med särskilda transkriptionsfaktorer 5.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% gradient TBE gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6225BOX</td>
			<td>Step B, 6.3 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 x T4 DNA Ligase Buffer with PEG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46300018</td>
			<td>Step B, 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% TBE gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6263BOX</td>
			<td>Step B, 6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 100 Assay </td>
			<td>Agilent Technologies </td>
			<td>5067-1504</td>
			<td rowspan="3">Step B, 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Assay</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2940CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube Filters (Spin-X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS8160</td>
			<td>Step B, 3.7 and 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark Reader Transilluminator</td>
			<td>Clare Chemical Research</td>
			<td>DR46B</td>
			<td>Step B, 6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Sonifier Cell Disrupter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>450D-0101063591</td>
			<td>Step A, 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
			<td>Step A, 7.5.1 Step B, for all magnetic beads washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-15 Magnet (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.01D</td>
			<td>Step A, 5 and 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-PCR (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>49-2025</td>
			<td>Step B, 6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DNA Polymerase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0209</td>
			<td>Step B, 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Step A, 7.5.1 Step B, 4.3 and 6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina cBot Cluster Generation System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-301-2002</td>
			<td>Step B, 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Genome Analyzer IIx</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-301-1301</td>
			<td>Step B, 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina PE primers</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-102-1004</td>
			<td>Step B, 5.4 (if necessary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Mixer </td>
			<td>Palico Biotech</td>
			<td>RM-2L</td>
			<td>Step B, any incubations with rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Real-Time PCR System</td>
			<td>Roche </td>
			<td>04 640 268 001</td>
			<td>Step A, 7.5.3 Step B, 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03 752 186 001</td>
			<td>Step B, 7.5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-280 Streptavidin Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11206D</td>
			<td>Step B, 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic (Dynabeads) Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100.03D</td>
			<td>Step A, 5.1.1 and 5.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract High Density (2ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td>Step A, 7.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract High Density (50ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129073</td>
			<td>Step B, 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MmeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0637</td>
			<td>R0637</td>
		</tr>
		<tr>
		 <td>RNase ONE Ribonuclease</td>
		 <td>Promega</td>
		 <td>M426C</td>
		 <td>Step B, 4.8</td>
	 </tr>
		<tr>
			<td>RNA Polymerase II (8WG16) monoclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-126R </td>
			<td>Step A, 5.2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tubes (Polypropylene)</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>Step A, 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tubes (Teflon FEP)</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Step B, 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity Master Mix</td>
			<td>Finnzymes</td>
			<td>F-531</td>
			<td>Step B, 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picogreen (Quant-iT) dsDNA Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Step A, 7.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Test Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352057</td>
			<td>Step A, 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Step A, 1.6 onwards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution (20mg/ml)</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>E00491</td>
			<td>Step A, 4.4, 7.5.1 
			Step B, 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EL0013</td>
			<td>Step B, 2.2, 3.9 and 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer (NEB)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>Step B, 3.3 and 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4215</td>
			<td>Step B, 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201</td>
			<td>Step B, 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq SBS Kit v5&#x2013;GA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-104-5001</td>
			<td>Regents for Illumina Genome Analyzer IIx system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq PE Cluster Kit v2&#x2013;cBot&#x2013;GA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-300-2001</td>
			<td>to be use with Illumina cBot Cluster Generation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-7585</td>
			<td>Step B, 6.3 and 6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Step B, 6.3 and 6.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td colspan="2">Sequence</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Biotinylated half-linkers A (200ng/&mu;l)</td>
			<td>Top</td>
			<td>5' GG CCG CGA/iBiodT/ ATC TTA TCC AAC 3'</td>
			<td>250 nmole scale HPLC Purified Internal Biotin dT(9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bot</td>
			<td>5' GTT GGA TAA GAT ATC GC 3'</td>
			<td>250 nmole scale HPLC Purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Biotinylated half-linkers B (200ng/&mu;l)</td>
			<td>Top</td>
			<td>5' GGC CGC GA/iBiodT/ ATA CAT TCC AAC 3'</td>
			<td>250 nmole scale HPLC Purified Internal Biotin dT(9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bot</td>
			<td>5' GTT GGA ATG TAT ATC GC 3'</td>
			<td>250 nmole scale HPLC Purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Non-biotinylated half-linkers (200ng/&mu;l)</td>
			<td>Top</td>
			<td>5' GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3'</td>
			<td>250 nmole scale PCR Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bot</td>
			<td>5' GTT GGA TCC GAT ATC GC 3'</td>
			<td>250 nmole scale PCR Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">GS20 Adaptor A (200ng/&mu;l)</td>
			<td>Top</td>
			<td>5' CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3'</td>
			<td>250 nmole scale PCR Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bot</td>
			<td>5'CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3'</td>
			<td>250 nmole scale PCR Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">GS20 Adaptor B (200ng/&mu;l)</td>
			<td>Top</td>
			<td>5' CTG AGA CAC GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3'</td>
			<td>250 nmole scale PCR Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bot</td>
			<td>5' CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3'</td>
			<td>250 nmole scale PCR Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Illumina-NN adaptors</td>
			<td>Top</td>
			<td>5' ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3'</td>
			<td>250 nmole scale HPLC purified See Step B, 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bot</td>
			<td>5' phos - GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3'</td>
			<td>250 nmole scale HPLC purified Phosphorylated 5' end See Step B, 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina 1-454 (forward) primer (10 &mu;M)</td>
			<td colspan="2">5' AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3'</td>
			<td>250 nmole scale PCR Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina 2-454 (reverse) primer (10 &mu;M)</td>
			<td colspan="2">5' CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3'</td>
			<td>250 nmole scale PCR Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primer 1.1 (10 &mu;M)</td>
			<td colspan="2">5' AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG AT 3'</td>
			<td>10nmole scale PCR Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primer 2.1 (10 &mu;M)</td>
			<td colspan="2">5' CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3'</td>
			<td>10nmole scale PCR Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina 3-454 sequencing primer (100 &mu;M)</td>
			<td colspan="2">5'TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3'</td>
			<td>100nmole scale HPLC Purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina 4-454 sequencing primer (100 &mu;M)</td>
			<td colspan="2">5'GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AG 3'</td>
			<td>100nmole scale HPLC Purified</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of oligos and adaptors. Order oligos from Integrated DNA Technologies (IDT) and prepare linkers and adaptors in the same manner as described previously10. Half-linkers and adaptors may be prepared beforehand and stored for several months at -20 &deg;C.

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

Genomen är organiserade i tre-dimensionella strukturer, anta högre ordning konformationer inuti micron stora nukleära utrymmen 7, 2, 12. Sådana arkitekturer är inte slumpmässiga och omfatta samspel mellan genpromotorer och reglerande element 13. Bindningen av transkriptionsfaktorer till specifika regulatoriska sekvenser åstadkommer ett nätverk av transkriptionsreglering och samordning 1, 14. Kromatin Interaction Analysis genom parade-End Tag sekvensering (CHIA-PET) har utvecklats för att identifiera dessa högre ordningens kromatin strukturer 5,6. Cellerna fixeras och samverkande loci fångas upp av kovalenta DNA-protein tvärbindningar. För att minimera icke-specifik brus och minska komplexiteten, samt att öka specificiteten av kromatin interaktionen analys är kromatin immunoprecipitation (chip) som används mot specifika proteiner faktorer för att berika kromatin fragment av intresse innan närhet ligering. Ligering där halva linkers bildar därefter kovalenta bindningar mellan par av DNA-fragment bundna tillsammans inom enskilda kromatin komplex. De flankerande MmeI restriktionsenzymställen i halv-linkers tillåta extraktion av parade end tagg-linkerkombination-tagg konstruktioner (PET) vid MmeI digerering. Som halv-linkers är biotinylerade, dessa PET konstruktioner renas med streptavidin-magnetiska pärlor. De renade teknik ligeras med nästa generations sekvensering adaptrar och en katalog av samverkande fragment genereras via nästa generations sequencers som Illumina Genome Analyzer. Kartläggning och bioinformatik analys utförs därefter för att identifiera Chip-berikade bindande platser och Chip-berikade kromatin interaktioner 8. Vi har tagit fram en video för att visa kritiska aspekter av Chia-PET-protokollet, särskilt utarbetandet av chip som kvaliteten på ChIP spelar en viktig roll i resultatet av en CHIA-PET bibliotek. Såsom protokollenmycket lång, bara de kritiska stegen som visas i videon.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Kromatin Interaction Analysis genom parvisa sluttagg sekvensering (CHIA-PET) är en metod för<em&gt; De novo</em&gt; Upptäckt av kromatin interaktioner, för bättre förståelse av transkriptionell kontroll.

Kromatin Interaktion Analys med parade-End Tag sekvensering (CHIA-PET) för kartläggning kromatin Interaktioner och förstå transkriptionsreglering

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

En kromatin-analys för mänskliga hjärnvävnaden

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Kromatin Immunoprecipitation från mänskliga embryonala stamcellslinjer

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Enstaka Läs och Paired End-mRNA-Seq Illumina bibliotek från 10 nanogram Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Kromatin Immunoutfällning (chip) med användning av Drosophila Vävnad

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Av hög kvalitet om Kromatin Immunoprecipitation DNA Mall för hög genomströmning sekvensering (chip-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Generation och rening av mänskliga INO80 Chromatin Remodeling Komplex och subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Biokemiska analyser för att analysera aktiviteter av ATP-beroende Chromatin Remodeling Enzymer

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Kromatin Immunoprecipitation analys för identifiering av Arabidopsis Protein-DNA-interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolering av specifika genomregioner och Identifiering av associerade molekyler av enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...