Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Yazarlar Singapur A * STAR tarafından desteklenmektedir. Buna ek olarak, MJF Bilim Bursu ve Lee Kuan Yew Doktora Sonrası Araştırma Bursu kadınlar için bir A * STAR Ulusal Bilim Bursu, bir L&#39;Oreal tarafından desteklenmektedir. YR NIH KODLAMASI hibe (R01 HG004456-01 ve R01 HG003521-01) tarafından desteklenmektedir. Yazarlar ayrıca video düzenleme ve için Bayan Michelle Teo için Bayan Siti Rahim sahneleri filme özellikle Sayın Kelvin Issey, Bay Chang Kai Xiang ve Sayın Sherwin Gan 8 Piksel Productions, Singapur, videografisi ekibi kabul voice-over.

<ol>
	<li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB1+packages+densely+looped,+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes.">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li><li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+replication+and+transcription.">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li><li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states.">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li><li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei.">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li><li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing.">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22 (2010).</li><li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation.">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li><li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis.">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12 (2007).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li><li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+at+a+distance:+DNA-looping+and+initiation+of+transcription.">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li><li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Chia-PET transkripsiyon regülasyonu uzun menzilli etkileşimleri tanımlamak için geliştirilmiş bir yöntemdir. Bir Chia-PET kütüphane kalitesini belirleyen önemli faktörlerden biri ChIP malzeme kalitesidir. Video gösterilen protokol hücre çapraz-bağlamak için EGS ve formaldehit kullanımını içerir. Uzun ayırıcı kolu taşıyan ikinci bir çapraz bağlama reaktifi ile birlikte formaldehit tek başına kullanımı 3,11,15 formaldehit bağlı olamazdı proteinlerin bağlanmasında yardımcı olabilir. Biz sağlam bağlayıcı siteleri ve uzun menzilli etkileşimleri 9 göstermiştir bu yöntem ile kütüphaneler inşa ettik. Ancak, çapraz bağlama ve ChIP koşulları ilgi her faktör için optimize edilmeli ve çapraz bağlama çok sonication tarafından parçalanma zorluklara neden olacak gibi değil aşırı kroslink önemlidir ve muhtemelen sahte kromatin etkileşimleri neden olabilir . Kromatin etkileşimleriChia-PET tarafından tanımlanan tür floresan in-situ hibridizasyon 4 gibi farklı bir yöntem ile valide edilmelidir. Biz kromatin malzeme 100 ng asgari öneririz. Biz kromatin malzeme 50 ng kaliteli kütüphaneler inşa ederken, biz başlangıç ​​materyali büyük miktarlarda izin verdiğini gözlemledim az 16 PCR döngüleri, böylece minimize amplikonlarının ve her kütüphane artıklık ile Chia-PET kütüphanelerinin yapımı. Bu düşük artıklık böylece sıralama daha az şeritli daha kapsamlı bir kromatin etkileşim haritası sağlayan, yüksek benzersiz eşlenen etiketleri ve ayrıca kullanılabilir veri oranı yüksek korelasyon. Her bir tüp içinde boncuk nihai paketlenmiş hacim sırasıyla manyetik ve Sepharose boncuklar için 50 ul ve 100 ul olmalıdır. Dolu boncuk hacmi belirtilenden daha az ise, DNA taşıyan boncuk kaybını en aza indirmek için benzer önceden temizlenmiş boş manyetik ya Sepharose boncuklar ile minimum dolu ses getirmeksonraki adımlarda s. Sawed-off ipucu ya da çok-çekirdekli kriteri Sepharose boncuklar pipetleme için kullanılmalıdır. Aşağıdaki değişiklikler önceden yayınlanmış Chia-PET protokolü 5 takiben dahil edildi. Öncelikle, manyetik G boncuk yıkama sırasında numune kaybını minimize etmek için kullanılmıştır. Ayrıca, kendi kendine bağlanan yarım bağlayıcılar ve / veya adaptörler amplikonlarının olacak 100 bp ve 138 bp yaklaşık boyutları ile non-spesifik bantları belirlendi. Bu yüzden, PCR amplifikasyon sırasında spesifik olmayan şeritler en aza indirmek için biyotinile yarı-bağlayıcılara ve 454 GS20 adaptörleri konsantrasyonu azalır. Yakınlığı ligasyonu hacmi sonraki saflaştırma adımları sırasında numune kaybını en aza indirmek ve aynı zamanda reaktif maliyetlerinde tasarruf için 50 ml 10 ml düşürülmüştür. Biz de streptavidin boncuklar üzerinde Chia-PET DNA maksimal yakalama sağlamak için boncuk Chia-PET DNA sabitlemek için inkübasyon süresi arttı. Yakınlığı ligasyonu adım sırasında, kimerik ligasyonu that kaçınılmaz bir spesifik olmayan ve rasgele bir şekilde üretilir vivo kromatin etkileşimleri gerçek temsil etmemektedir. Bu nedenle, herhangi bir Chia-PET deneme veri kalitesini değerlendirmek için, kimerizm oranı belirli nükleotid barkod TAAG ve ATGT 5 ile iki farklı yarı linkers kullanımı tahmin edilmektedir. Yüksek verimli sekanslama sonra, Chia-PET dizileri ilk 8 ayırt edilebilen belirli Ligasyon ürünleri ve non-spesifik ürünlerden elde edilen ligasyon bağlayıcının barkod kompozisyon ve sekansları için analiz edilir. Bilinen kimeralar yüzdesi (yani heterodimerler AB linkers) bizim in-house MCF-7 RNA Polimeraz II Chia-PET kütüphaneler az% 15 sunuyoruz. Chia-PET dizileri sonradan olmak üzere iki kategoride, kendinden ligasyonu PET ve inter-ligasyon PET ayrılır. Arası ligasyon PET ı elde edilir kendinden-ligasyon PET kromatin fragmanlarının kendi Sirkülasyon ligasyon elde edilmiştiriki farklı DNA parçaları arasında nter-ligasyonu. İkincisi daha sonra aynı kromozom (intrachromosomal arası ligasyonu PET) veya iki etiketi iki farklı kromozom (interchromosomal arası ligasyonu PET) eşlenen her etiketi genomik mesafeye göre üç farklı kategoride alt grupları oluşturmaktadır. Biz farklı kategorilerde 8 dışarı sıralamak için bir Chia-PET aracı yazılım paketi geliştirdik. Bu kütüphane olan DNA fragmanları üzerinde bağlı olacaktır. Genellikle, küçük ChIP parçaları daha yüksek bir çözünürlüğe vermek ve 4 kb hakkında bu RNA Polimeraz II Chia-PET kütüphaneler için kesecek. Buna ek olarak, gerçek kromatin etkileşimleri bir etkileşim kümedeki arası ligasyonu PET sayısını sayarak rastgele gürültü ayırt edilebilir, diğer bir deyişle, yüksek PET sayısı bir küme gerçek kromatin etkileşimi 8 olma ihtimali daha yüksek olduğu söyleniyor . Bir yalancı pozitif filtrelemek içinrastgele tesadüflerle arası ligasyonu PET oluşabilir zenginleştirilmiş çapa yükselecek, bir istatistiksel analiz çerçevesi de iki ankraj 8 arasındaki inter-ligasyon PET rasgele oluşumu için hesap için formüle edilmiştir. Sonuç olarak, Chia-PET tekniği küresel ölçekte kromatin etkileşim ağları haritalama sağlar. Chia-PET ChIP uygulanması kütüphanesi karmaşıklığı ve arka plan gürültüsünün azalmasını sağlar. Buna ek olarak, belirli ChIP transkripsiyon faktörleri 5 ile bağlantılı spesifik kromatin etkileşimlerin inceleme sağlayan, kromatin etkileşimleri için özgüllüğü ekler.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> % 4-20 gradyanı TBE jel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> B, 6.3 Adım </td></tr><tr><td> PEG ile 5 x T4 DNA Ligaz Tamponu </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> B aşaması, 2.2 </td></tr><tr><td> % 6 TBE jeli </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> B, 6.8 Adım </td></tr><tr><td> Agilent DNA 100 Testi </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> B aşaması, 7.1 </td></tr><tr><td> Agilent Yüksek Hassasiyet DNA Testi </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> (Spin-X) Tüp Filtreler santrifüjleyin </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Adım B, 3.7 ve 6.9 </td></tr><tr><td> Koyu Okuyucu transilluminator </td><td> Clare Kimya Araştırma </td><td> DR46B </td><td> B, 6.8 Adım </td></tr><tr><td> Dijital Sonifier Hücre bölücü </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> A, 4.3 Adım </td></tr><tr><td> DynaMag-2 mıknatıs (Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Adımları yıkama tüm manyetik boncuk, A, 7.5.1 Adım Adım B </td></tr><tr><td> DynaMag-15 Mıknatıs (Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> A, 5 ve 6 Adım </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> B, 6.5 Adım </td></tr><tr><td> Escherichia coli DNA polimeraz I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> B, 5.6 Adım </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> A, 7.5.1 Adım B, 4.3 ve 6.5 Adım </td></tr><tr><td> Illumina CBOT Küme Üretim Sistemi </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> B aşaması, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina Genom Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> B aşaması, 7.5 </td></tr><tr><td> Illumina PE astar </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Adım B, 5.4 (gerekli ise) </td></tr><tr><td> Intelli-Mikser </td><td> Palico Biyoteknoloji </td><td> RM-2L </td><td> , Rotasyon ile herhangi inkübasyonlar B Adım </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR Sistemi </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> A, Adım B 7.5.3, 7.3 Adım </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Adım B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Streptavidin Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> B, 5.2 Adım </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Manyetik (Dynabeads) Protein G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> A, 5.1.1 ve 5.2.1 Adım </td></tr><tr><td> Yüksek Yoğunluk (2ml) MaXtract </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> A, Adım 7.5.1 </td></tr><tr><td> Yüksek yoğunluklu (50ml) MaXtract </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> B aşaması, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNaz ONE Ribonükleaz </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> B aşaması, 4.8 </td></tr><tr><td> RNA polimeraz II (8WG16) monoklonal antikor </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> A, Adım 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Santrifüj Tüpleri (Polipropilen) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> A, 3.1 Adım </td></tr><tr><td> Oak Ridge Santrifüj Tüpleri (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> B aşaması, 4.3 </td></tr><tr><td> Phusiyon High Fidelity Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> B, 6 Adım </td></tr><tr><td> PicoGreen (Quant-iT) dsDNA Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> A, 7.5.2 Adım </td></tr><tr><td> Polistiren Yuvarlak Dip Tüp </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> A, 4.1 Adım </td></tr><tr><td> Proteaz İnhibitör Kokteyl tabletler (tam, EDTA-ücretsiz) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> A, 1.6 yılından Adım </td></tr><tr><td> Proteinaz K Çözüm (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> 7.5.1, 4.4 Adım A B aşaması, 4.1 </td></tr><tr><td> T4 DNA Ligaz </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Adım B, 2.2, 3.9 ve 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA Ligaz Tamponu (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Adım B, 3.3 ve 3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNA polimeraz </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>B aşaması, 1.2 </td></tr><tr><td> T4 DNA polinükleotid kinaz </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> B, 3.3 Adım </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Takımı v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Illumina Genom Analyzer IIx sistemi için Regents </td></tr><tr><td> TruSeq PE Küme Takımı v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> Illumina CBOT Küme Üretim Sistemi ile kullanım olmak </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Adım B, 6.3 ve 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini Hücre Elektroforez Sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Adım B, 6.3 ve 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td colspan="2"> Sıra </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biyotinile yarı-bağlayıcı A (200ng/μl) </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TTK AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC Saflaştırılmış İç Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC Saflaştırılmış </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinlenmiş yarım linkers B (200ng/μl) </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TTK AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC Saflaştırılmış İç Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC Saflaştırılmış </td></tr><tr><td rowspan="2"> Sigara biotinlenmiş yarım linkers (200ng/μl) </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptör A (200ng/μl) </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;CCA TCT CAT CCC TGC GTG TTK CATCTG TTC SKK CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptör B (200ng/μl) </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;CTG AGA CAC GKRY ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;CCT ATC CCC TGT GTG SKK TGC CTA TTK SKK GTT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN adaptörleri </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC saflaştırılmış Adım B, 5.4 &#39;e bakınız </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;fosfat - GAT CGG AAG AGC GGT TCA GKRY GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC saflaştırılmış 5 &#39;ucu Adım B, 5.4&#39; e bakınız fosforile </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (ileri) astar (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TTK SKK GTG TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (ters) astar (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GKRY GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1,1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;3 saat AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG&#39; </td><td> 10nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2,1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GKRY GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 dizileme astar (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TTK CAT CTG TTC SKK CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole ölçekte HPLC Saflaştırılmış </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 dizileme astar (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG SKK TGC CTA TTK SKK GTT GCG TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole ölçekliHPLC Saflaştırılmış </td></tr></tbody></table> Entegre DNA Technologies (IDT) ve aynı şekilde bağlayıcı ve adaptörleri hazırlamak gelen Oligolar ve adaptörler Tablo. Sipariş Oligolar önce 10 nitelendirdi. Yarı-bağlayıcı ve adaptörler -20 ° C&#39;de birkaç ay önceden hazırlanmalı ve saklanabilir

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

Genomları mikron büyüklüğünde nükleer uzaylar 7 içindeki üst düzey konformasyonları, 2, 12 benimseyerek, üç boyutlu yapıları halinde düzenlenmiştir. Böyle mimarileri rastgele değildir ve gen destekçileri ve düzenleyici unsurları 13 arasındaki etkileşimleri içerir. Belirli düzenleyici dizileri transkripsiyon faktörleri bağlayıcı transkripsiyon regülasyonu ve koordinasyon 1, 14 bir ağ beraberinde getirmektedir. Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi bu yüksek mertebeli kromatin yapılarına 5,6 tanımlamak için geliştirilmiştir. Hücreler sabit ve etkileşen loci kovalent DNA-protein çapraz bağlantıları tarafından yakalanır. Non-spesifik gürültü en aza indirmek ve karmaşıklığı azaltmak, hem de kromatin etkileşim analizi özgüllüğünü artırmak için, kromatin immünopresipitasyon (çip) yakınlık ligasyon önce ilgi çekici parçaları kromatin zenginleştirmek için spesifik protein faktörlere karşı kullanılır. Yarım linkers içeren Ligasyonu sonradan bireysel kromatin kompleksleri içinde birlikte gergin DNA parçalarının çiftleri arasındaki kovalent bağlantılar oluşturur. Yarım linkers in sınırdaş MmeI restriksiyon enzimi siteleri MmeI sindirim eşleştirilmiş bitiş etiketi-linker-tag yapıları (PET) çıkarımı izin verir. Yarı-linkerler biotinlenmiş olduğu için, bu PET yapıları streptavidin-manyetik boncuklar kullanılarak arıtılır. Arıtılmış PET nesil dizileme adaptörler ve etkileşim parçaları bir katalog gibi Illumina Genom Analyzer gibi yeni nesil sequencer ile oluşturulan ile bağlandı edilir. Haritalama ve biyoinformatik analizi ardından 8 siteleri ChIP-zenginleştirilmiş bağlama ve ChIP zenginleştirilmiş kromatin etkileşimleri belirlemek için yapılır. Biz ChIP kalitesini bir Chia-PET kütüphane sonucu önemli bir rol oynar gibi özellikle Chia-PET protokolü, ChIP hazırlanması kritik yönlerini göstermek için bir video hazırladık. Protokolleri olduğundanÇok uzun, ancak kritik adımlar video gösterilir.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi için kullanılan bir yöntemdir<em&gt; De novo</emTranskripsiyonel kontrolü daha iyi anlaşılması için kromatin etkileşimlerin&gt; algılama.

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

10 nanogram Total RNA tek okuyun ve Eşleştirilmiş Sona mRNA-Seq Illumina Kütüphaneler

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...