Name: skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

Ontwikkeling van dit protocol werd gefinancierd door het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM, TR1-01246) en Parkinson Alliance.

De huid punch biopsie verkregen met behulp van standaard procedure 3 (bijvoorbeeld verkregen met 4mm ronde Visipunch instrument) moeten in volledige DMEM 20% FBS media worden bewaard op ijs. Nadat het monster is aangekomen in het laboratorium verwerken biopsie zo spoedig mogelijk. 1. Voorbereiding van de huid Punch biopsie STEPS 1,1-1,3 IS BINNEN EEN bioveiligheid kast TE VOEREN <ol><li> Bereid vooraf Voeg 1 ml van 0.1% gela...

<ol>
	<li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress.">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li><li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson's+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication.">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li><li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=biopsy+of+the+skin.">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).</li><li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin+embedded+tissue+specimens.">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li></ol>

Met dit protocol, kan relatief zuivere culturen van de huid fibroblasten worden verkregen. De fibroblasten hebben karakteristieke morfologische kenmerken van langwerpige, spindel-achtige cellichamen, rond tot ovaal celkernen, en de fibroblasten groeien uitgelijnd en in bundels bij samenvloeiing. De media ondersteunt de groei van fibroblasten terwijl andere celpopulaties zoals keratinocyten nodig extra toeslagen en groeifactoren, of zijn mitotically minder actief, dit zorgt voor relatief zuiver fibroblastculture...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>S6E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 cm Tissue Culture Petri dish</td>
 <td>VWR</td>
 <td>25382-166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well Tissue Culture plate </td>
 <td>VWR</td>
 <td>73520-906</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21909-660</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile pointed-tip forceps</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 mL Conical tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-940</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-894</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-896</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>14672-380</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Table A. Table of specific reagents and equipments.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent</td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X DMEM: High Glucose</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11960-069</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20% Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>26140-079</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>25030-164</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X MEM Non-essential Amino Acids </td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11140-076</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>15140-163</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table B. Reagents.

skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts

Weefsels en cellijnen afgeleid van een individu met de ziekte zijn ideaal bronnen ziektegerelateerde cellulaire fenotypes bestuderen. Patiënten afkomstige fibroblasten in dit protocol zijn met succes gebruikt bij de afleiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen tot modelziekte 1. Vroege passages van deze fibroblasten kunnen ook worden gebruikt voor cel-gebaseerde functionele assays voor specifieke biologische veranderingen, mechanismen 2 en volgende geneesmiddelen screeningsmethoden bestuderen. Het voordeel van het gepresenteerde protocol via enzymatische procedures zijn 1) de reproduceerbaarheid van de techniek van kleine hoeveelheden weefsel afkomstig van oudere patiënten, bijvoorbeeld patiënten die met de ziekte van Parkinson, 2) de technisch eenvoudige benadering via moeilijker methodologieën middels enzymatische behandelingen, en 3 ) de tijd houden: dit protocol duurt 15-20 minuten en kan direct na aankomst biopsie worden uitgevoerd. Enzymatische behandelingen kan tot 4 uur en hebben de problemen vanoverdigestion, vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen en de daaropvolgende aanhechting van cellen wanneer ze niet goed behandeld. Dit protocol beschrijft de ontleding en de bereiding van een 4-mm menselijke huidbiopsie voor het afleiden van een fibroblast cultuur en heeft een zeer hoog slagingspercentage wat belangrijk is bij de behandeling van patiënten afkomstige weefselmonsters. In deze cultuur, keratinocyten migreren uit de biopsie weefsel binnen de eerste week na de bereiding. Fibroblasten weergegeven 7-10 dagen na de eerste uitloper van keratinocyten. DMEM hoge glucose media aangevuld met 20% FBS bevordert de groei van fibroblasten dan keratinocyten en fibroblasten zal de keratinocyten overwoekeren. Na 2 passages keratinocyten werden verdund uit wat resulteert in relatief homogene fibroblastculturen die de fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47) uitdrukt. Met deze aanpak kan 15-20000000 fibroblasten worden afgeleid in 4-8 weken voor mobiele bankieren. De huid dissectie duurt ongeveer 15-20 minuten, worden de cellen dan een keer per dag bewaaktonder de microscoop, en de media werden elke 2-3 dagen na hechting en uitgroei van cellen.

Keratinocyten groeien uit de biopsie stukken zo spoedig 48 uur na dissectie. Eerste fibroblasten uitgroei kan worden waargenomen ongeveer een week na verwerking. Zodra de putjes confluentie hebben bereikt, worden fibroblasten gepasseerd voor twee passages op drie 150 cm kolven (T150) te bereiken en de cellen worden ingevroren. We genereren deze werkwijze 15-20.000.000 cellen. De fibroblasten zijn positief voor anti-SERPINH1 (ook bekend als HSP-47) (figuur 1), die een collageen-specifieke moleculaire cha...

Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

De fibroblast explantaatkweek protocol uit menselijke huid stansbiopsieën is een technisch robuuste en eenvoudige manier om huidcellen te leiden binnen 4-8 weken voor het bankwezen van ongeveer 15-20 miljoen cellen bij een lage passage nummer.

Huid Punch Biopsie Explantatiestatus Cultuur voor Afleiding van primaire humane fibroblasten

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s) van Human Borst fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro organoïde Cultuur van primaire Mouse Colon Tumoren

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primaire cultuur van de mens Vestibular Schwannomen

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified BergstrÃƒÆ’Ã‚Â¶m Technique

Human Skeletal Muscle biopsie procedures met behulp van de Modified Bergström Techniek

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Oprichting van Human Epithelial Enteroids en Colonoids van Whole Tissue en Biopsie

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

menselijk<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; Skeletal spierbiopsie Met behulp van de Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Weefsel karakterisering na een New Uitsplitsing Methode voor de huid Micro-Enten Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Driedimensionale alginaat-bead cultuur van de mens hypofyseadenoom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...