Name: skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

פיתוח של פרוטוקול זה מומן על ידי מכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית (CIRM, TR1-01246) ופרקינסון הברית.

עור אגרוף ביופסיה שהושגה באמצעות הליך רגיל 3 (המתקבל לדוגמה עם 4 מ&quot;מ מכשיר Visipunch סיבוב) צריך להיות כל הזמן ב20% FBS DMEM מלא תקשורת על קרח. לאחר המדגם הגיע במעבדה, לעבד את הביופסיה בהקדם האפשרי. 1. הכנת עור אגרוף הביופסיה <p clas...

<ol>
	<li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress.">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li><li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson's+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication.">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li><li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=biopsy+of+the+skin.">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).</li><li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin+embedded+tissue+specimens.">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li></ol>

עם פרוטוקול זה, ניתן להשיג תרבויות טהורות יחסית של fibroblasts העור. יש את fibroblasts תכונות מורפולוגיות אופייניות של גופים מוארכים, דמויי כישור סלולרי, עגולים לגרעין תא סגלגל, ואת fibroblasts לגדול ומיושר בצרורות כאשר מחוברות. התקשורת תומכת בצמיחה של fibroblasts אילו אוכלוסיות תאי הקרט?...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>S6E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 cm Tissue Culture Petri dish</td>
 <td>VWR</td>
 <td>25382-166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well Tissue Culture plate </td>
 <td>VWR</td>
 <td>73520-906</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21909-660</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile pointed-tip forceps</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 mL Conical tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-940</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-894</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-896</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>14672-380</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Table A. Table of specific reagents and equipments.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent</td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X DMEM: High Glucose</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11960-069</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20% Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>26140-079</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>25030-164</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X MEM Non-essential Amino Acids </td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11140-076</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>15140-163</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table B. Reagents.

skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts

רקמות ושורות תאים שמקורם אדם עם מחלה הן מקורות אידיאליים ללמוד פנוטיפים סלולריים הקשורות למחלה. fibroblasts מטופל שמקורם בפרוטוקול זה היה בשימוש בהצלחה בנטילה של תאי גזע pluripotent מושרה למחלת מודל 1. קטעים ראשונים של fibroblasts אלה יכולים לשמש גם עבור מבחני תפקודיים מבוססי תאים ללמוד מסלולים ספציפיים, מנגנוני מחלה 2 ולאחר מכן סמים גישות הקרנה. היתרון של הפרוטוקול שהוצג על הליכים אנזימטיות הוא 1) שחזור של הטכניקה מכמויות קטנות של רקמות הנגזרות מחולים מבוגרים, חולים כגון החולים במחלת פרקינסון, 2) גישה טכנית הפשוט על מתודולוגיות מאתגרות יותר באמצעות טיפולים אנזימטיות, ו3 ) שיקול הזמן: פרוטוקול זה לוקח 15-20 דקות ויכול להתבצע מייד לאחר הגעתו ביופסיה. טיפולים האנזימטית יכולים לקחת עד 4 שעות ויש לי את הבעיות שלoverdigestion, הפחתה של כדאיות תא ולאחר מכן קובץ מצורף של תאים, כאשר לא מטופל כראוי. פרוטוקול זה מתאר את הנתיחה והכנת עור אנושי 4 מ&quot;מ ביופסיה לגזירה של תרבות פיברובלסטים ויש לו אחוזי הצלחה גבוהה מאוד וזה חשוב בעת ההתמודדות עם דגימות רקמת מטופל הנגזרות. בתרבות זו, קרטינוציטים נודדים מרקמת הביופסיה בתוך השבוע הראשון לאחר הכנה. Fibroblasts להופיע 7-10 ימים לאחר התוצאה הראשונה של קרטינוציטים. תקשורת גלוקוז גבוהה DMEM בתוספת 20% FBS מעדיפה את הצמיחה של fibroblasts על קרטינוציטים וfibroblasts תהיה לגדול יותר את הקרטינוציטים. לאחר 2 קטעים כבר דילול את הקרטינוציטים וכתוצאה מתרבויות פיברובלסטים הומוגניות יחסית, המבטאת את סמן SERPINH1 פיברובלסטים (HSP-47). השימוש בגישה זו, ניתן לגזור 15-20 מיליון fibroblasts בשבועות 4-8 לבנקאות סלולרי. נתיחת העור לוקחת בערך 15-20 דקות, ולאחר מכן תאים מנוטרים פעם ביוםמתחת למיקרוסקופ, והתקשורת משתנה כל 2-3 ימים לאחר התקשרות ותולדה של תאים.

קרטינוציטים צומחים מתוך יצירות הביופסיה בהקדם 48 שעות לאחר ניתוח. תולדת fibroblasts הראשונה ניתן לראות כשבוע לאחר עיבוד. ברגע שהגיעו לבארות confluency, fibroblasts הוא passaged לשני קטעים נוספים כדי להגיע לשלוש צלוחיות 150 ס&quot;מ (T150) ותאי cryopreserved. אנו מייצרים בשיטה זו 15-20 מיליון תאים. את fibrob...

Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

פרוטוקול תרבות explant פיברובלסטים מביופסיות אגרוף עור אנושי הוא דרך פשוטה וחזקה מבחינה טכנית להפיק תאי עור בתוך 4-8 שבועות לבנקאות של כ 15-20 מיליון תאים במספר מעבר נמוך.

תרבות explant עור אגרוף ביופסיה לגזירה של fibroblasts אדם היסודי

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

השימוש בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים לניטור פנוטיפים מיטוכונדריאלי בתחום מחלת פרקינסון

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

העיקרית של תרבות האנושית שיווי המשקל schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified BergstrÃƒÆ’Ã‚Â¶m Technique

נהלי ביופסיה של שריר שלד אנושי באמצעות טכניקת Bergstrom השתנה

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

בן אנוש<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; ביופסיה בשרירי השלד שימוש וייל-בלייסלי Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

אפיון רקמות לאחר שיטה חדשה חלוקה לעור מיקרו שתלי הדור

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...