Name: skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

Lo sviluppo di questo protocollo è stato finanziato dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, TR1-01246) e Parkinson Alliance.

La pelle biopsia ottenuta utilizzando procedura standard 3 (ad esempio ottenuto con 4 millimetri strumento Visipunch rotondo) dovrebbe essere tenuto in completo DMEM 20% FBS media su ghiaccio. Una volta che il campione è arrivato in laboratorio, elaborare la biopsia appena possibile. 1. Preparazione della pelle Punch Biopsia PASSI 1,1-1,3 DEVONO essere effettuata in un BIOSAFETY ARMADIO <ol><li> Preparare in anticipo: Aggiu...

<ol>
	<li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress.">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li><li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson's+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication.">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li><li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=biopsy+of+the+skin.">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).</li><li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin+embedded+tissue+specimens.">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li></ol>

Con questo protocollo, le culture relativamente pure di fibroblasti cutanei possono essere ottenuti. I fibroblasti hanno peculiari caratteristiche morfologiche, corpi cellulari mandrino-come allungate, rotonde a nuclei delle cellule ovali, ed i fibroblasti crescono allineati e in fasci, quando confluenti. I mezzi di comunicazione supporta la crescita dei fibroblasti, mentre altre popolazioni cellulari ad esempio cheratinociti bisogno supplementi e fattori di crescita, o sono mitoticamente meno attivi, ciò perm...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>S6E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 cm Tissue Culture Petri dish</td>
 <td>VWR</td>
 <td>25382-166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well Tissue Culture plate </td>
 <td>VWR</td>
 <td>73520-906</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21909-660</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile pointed-tip forceps</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 mL Conical tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-940</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-894</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-896</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>14672-380</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Table A. Table of specific reagents and equipments.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent</td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X DMEM: High Glucose</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11960-069</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20% Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>26140-079</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>25030-164</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X MEM Non-essential Amino Acids </td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11140-076</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>15140-163</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table B. Reagents.

skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts

Tessuti e linee cellulari derivate da un individuo con malattia sono fonti ideali per studiare fenotipi cellulari correlate alla malattia. Fibroblasti derivati ​​da pazienti in questo protocollo sono stati utilizzati con successo nella derivazione di cellule staminali pluripotenti indotte alla malattia modello 1. Primi passi di questi fibroblasti possono anche essere utilizzati per saggi funzionali a base di cellule per studiare percorsi specifici di malattia, meccanismi 2 e successive approcci di screening di stupefacenti. Il vantaggio del protocollo presentato nel corso procedure enzimatiche sono 1) la riproducibilità della tecnica di piccole quantità di tessuti derivati ​​da pazienti anziani, ad esempio, pazienti affetti da morbo di Parkinson, 2) l&#39;approccio tecnicamente semplice su metodologie più impegnativi utilizzando trattamenti enzimatici, e 3 ) il corrispettivo tempo: questo protocollo richiede 15-20 minuti e può essere eseguita subito dopo la biopsia arrivo. Trattamenti enzimatici possono richiedere fino a 4 ore e hanno i problemi dioverdigestion, riduzione della vitalità cellulare e la successiva collocazione delle cellule quando non gestita correttamente. Questo protocollo descrive la dissezione e la preparazione di una pelle umana 4 mm per biopsia derivazione di una coltura di fibroblasti e ha un tasso di successo molto alto che è importante quando si tratta di campioni di tessuti derivati ​​da pazienti. In questa cultura, cheratinociti migrano fuori dal tessuto biopsia entro la prima settimana dopo la preparazione. I fibroblasti compaiono 7-10 giorni dopo la prima conseguenza di cheratinociti. DMEM High Media glucosio addizionato con 20% FBS favorisce la crescita dei fibroblasti su cheratinociti e fibroblasti sarà invadere i cheratinociti. Dopo 2 passaggi cheratinociti sono stati diluiti in colture di fibroblasti con conseguente relativamente omogenei che esprime la fibroblasti marcatore SERPINH1 (HSP-47). Usando questo approccio, 15-20 milioni fibroblasti possono essere derivate in 4-8 settimane per la raccolta di cellule. La dissezione pelle dura circa 15-20 minuti, le cellule vengono poi monitorati una volta al giornosotto il microscopio, e dei media è cambiata ogni 2-3 giorni dopo il sequestro e la conseguenza di cellule.

Cheratinociti crescere senza i pezzi bioptici appena 48 ore dopo la dissezione. Prima fibroblasti escrescenza può essere osservato circa una settimana dopo l&#39;elaborazione. Una volta che i pozzi hanno raggiunto confluenza, i fibroblasti sono diversi passaggi per altri due passaggi per raggiungere tre 150 centimetri palloni (T150) e le cellule vengono crioconservati. Noi generiamo con questo metodo di 15-20 milioni cellule. I fibroblasti sono positivi per anti-SERPINH1 (noto anche come HSP-47) (Figura 1),</st...

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Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Il protocollo cultura espianto di fibroblasti da biopsie cutanee umane è un modo tecnicamente robusto e semplice per ricavare cellule della pelle all&#39;interno di 4-8 settimane per il settore bancario di circa 15-20 milioni di cellule in un numero basso passaggio.

Pelle Punch Biopsia Espianto Cultura per la derivazione di fibroblasti umani primari

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