Name: skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00
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このプロトコルの開発は再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM、TR1-01246）とパーキンソンアライアンスによって資金を供給された。

標準手順3（ 例えば 4ミリメートルラウンドVisipunch器で得られた）を使用して得皮膚パンチ生検は、氷の上で完全DMEM 20％FBS培地で保たれるべきである。いったんサンプルは実験室に到着した、できるだけ早く生検を処理する。 1。皮膚パンチ生検の準備 STEPS 1.1から1.3には、バイオセーフティキャビネット内で実行されるべきである...

<ol>
	<li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress.">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li><li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson's+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication.">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li><li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=biopsy+of+the+skin.">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).</li><li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin+embedded+tissue+specimens.">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li></ol>

このプロトコルを使用して、皮膚線維芽細胞の比較的純粋な培養物を得ることができる。線維芽細胞は楕円形の細胞核へのラウンド細長い紡錘状細胞体の特徴的な形態学的特徴を持っており、線維芽細胞が整列し、バンドル時合流で育つ。他の細胞集団などのケラチノサイトが追加料金と成長因子を必要とするか、有糸分裂活性が低いのに対し、メディアは線維芽細胞の成長をサポー?...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>S6E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 cm Tissue Culture Petri dish</td>
 <td>VWR</td>
 <td>25382-166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well Tissue Culture plate </td>
 <td>VWR</td>
 <td>73520-906</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21909-660</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile pointed-tip forceps</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 mL Conical tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-940</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-894</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-896</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>14672-380</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Table A. Table of specific reagents and equipments.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent</td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X DMEM: High Glucose</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11960-069</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20% Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>26140-079</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>25030-164</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X MEM Non-essential Amino Acids </td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11140-076</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>15140-163</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table B. Reagents.

skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts

疾患を有する個体由来の組織および細胞株は、疾患関連細胞表現型を研究するための理想的な供給源である。このプロトコルにおける患者由来の線維芽細胞を正常にモデル疾患1に人工多能性幹細胞の誘導に用いられてきた。これらの線維芽細胞の初期の通路はまた、特定の疾患経路、機構2およびそれに続く薬剤スクリーニング手法を研究するために、細胞ベースの機能アッセイに使用することができる。酵素手続き上提示プロトコルの利点は、1）酵素処理を用いた高齢患者、パーキンソン病、2に罹患例えば患者）より挑戦的な方法論の上に技術的に簡単なアプローチから派生した組織の少量からの技術の再現性、および3ですの）時間を考慮：このプロトコルは、15〜20分かかりますし、生検到着した直後に行うことができます。酵素処理は、4時間までかかるとの問題を抱えていることができます過剰消化、細胞の生存と正しく処理されていない細胞のその後のアタッチメントの削減。このプロトコルは、4mmのヒト皮膚線維芽細胞培養物の誘導のための生検の切開及び調製を記載し、患者由来の組織サンプルを扱うときに重要である、非常に高い成功率を有している。この文化では、ケラチノサイトは、調製後最初の一週間以内に生検組​​織の外に移行します。線維芽細胞は7-10日ケラチノサイトの最初の伸長後に表示されます。 20％FBSを添加したDMEM高グルコース培地はケラチノサイトおよび線維芽細胞上の線維芽細胞の成長がケラチノサイトの過剰増殖します好む。 2継代後ケラチノサイトは線維芽細胞マーカーSERPINH1（HSP-47）を発現する、比較的均質な線維芽細胞培養の結果から希釈されています。このアプローチを使用して、15から20000000線維芽細胞は、細胞バンキングのため4-8週間のうちに誘導することができる。皮膚切開は15-20分ほどかかり、その後、細胞を一日一回監視され顕微鏡下で、メディアは2〜3日ごとに細胞の付着と伸長した後に変更されます。

ケラチノサイトは解剖後の48時間とすぐに生検片の外に成長しています。最初の線維芽細胞の伸長は、処理後1週間程度を観察することができる。井戸がコンフルエントに達した後3 150センチメートルフラスコ（T150）と細胞に到達するには、2つ以上の通路は凍結保存されているため、線維芽細胞を継代する。我々はこの方法で15から20000000までのセルを生成します。線維芽細胞は、小胞体に局?...

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Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

ヒト皮膚パンチ生検からの線維芽細胞移植片培養プロトコルは、低継代数で約15〜20万人の細胞バンキングのため4-8週間以内に皮膚細胞を導出するために、技術的に堅牢かつ簡単な方法です。

プライマリーヒト線維芽細胞の導出のために皮膚パンチ生検植文化

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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パーキンソン病の分野におけるミトコンドリアの表現型を監視するための主要ヒト線維芽細胞の使用

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