Name: skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00
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이 프로토콜의 개발은 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM, TR1-01246)와 파킨슨 연합에 의해 투자되었다.

펀치 생검이 표준 절차 3 (예를 들어, 4mm 라운드 Visipunch 계기로 얻은)를 사용하여 얻은 피부는 얼음에 완전한 DMEM 20 % FBS 매체에 보관해야합니다. 일단 샘플을 실험실에 도착, 가능한 한 빨리 조직 검사를 처리합니다. 1. 피부 펀치 생검의 준비 단계 1.1-1.3는 생명 공학 안전성 캐비닛 내부 수행해야 할 <ol><li> 사전 준비 : ...

<ol>
	<li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress.">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li><li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson's+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication.">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li><li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=biopsy+of+the+skin.">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).</li><li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin+embedded+tissue+specimens.">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li></ol>

이 프로토콜을 통해 피부 섬유 아세포 상대적으로 순수 배양을 얻을 수 있습니다. 섬유 아세포는 타원형 세포 핵에 둥근 길쭉한, 스핀들 같은 세포 기관의 특성을 형태 학적 특징을 가지고 때 합류 섬유 아세포는 정렬 및 번들에서 성장. 매체는 섬유 아세포의 성장 예를 들어, 각질 추가 보충 및 성장 인자를 필요로하거나 세포 분열 덜 활성화되어 다른 세포 집단 반면이 상대적으로 순수한 ...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>S6E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 cm Tissue Culture Petri dish</td>
 <td>VWR</td>
 <td>25382-166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well Tissue Culture plate </td>
 <td>VWR</td>
 <td>73520-906</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21909-660</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile pointed-tip forceps</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 mL Conical tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-940</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-894</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-896</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>14672-380</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Table A. Table of specific reagents and equipments.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent</td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X DMEM: High Glucose</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11960-069</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20% Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>26140-079</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>25030-164</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X MEM Non-essential Amino Acids </td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11140-076</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>15140-163</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table B. Reagents.

skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts

질병을 가진 개인에서 파생 된 조직 및 세포 라인 질병 관련 세포의 표현형을 연구하는 이상적인 소스입니다. 이 프로토콜에서 환자 유래 섬유 아세포가 성공적으로 모델 병 1 유도 만능 줄기 세포의 유도에 사용되었습니다. 이 섬유 아세포의 초기 구절은 특정 질병 경로, 기계 2 및 후속 약물 검사 방식을 연구하기 위해 셀 기반 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 효소 절차를 통해 제시된 프로토콜의 장점은 1) 효소 처리를하여 노인 환자, 파킨슨 병, 2에 영향을 예를 들면 환자) 더 도전적인 방법론을 통해 기술적으로 간단한 방법에서 파생 된 조직의 소량의 기술의 재현성 및 3아르 ) 시간 고려 사항 :이 프로토콜은 15 ~ 20 분을 소요하고 생검 도착 후 바로 수행 할 수 있습니다. 효소 처리는 4 시간까지 걸릴와의 문제가있을 수 있습니다세포 생존 제대로 처리하지 세포의 후속 첨부 overdigestion, 감소. 이 프로토콜은 4 mm 인간의 피부 섬유 아세포 문화 유도를위한 생검의 해부 및 준비를 설명하고 환자 파생 된 조직 샘플을 다룰 때 중요한 매우 높은 성공률을 가지고 있습니다. 이 문화에서는, 각질이 준비 후 첫 일주일 이내에 생검 조직에서 마이그레이션 할 수 있습니다. 섬유 아 세포는 각질의 첫 번째 파생물 후에 7-10 일이 나타납니다. 20 % FBS와 보충 DMEM 높은 포도당 미디어 각질 섬유 아세포에 섬유 아세포의 성장 각질을 자랄 것입니다 하시 더군요. 이 구절 후 각질 섬유 아세포 마커 SERPINH1 (HSP-47)를 표현 비교적 균질 한 섬유 아세포 배양 결과 중 희석되었다. 이 방법을 사용하여 15-20000000 섬유 아세포는 세포 은행을위한 4-8 주 얻을 수 있습니다. 피부 절개는 15 ~ 20 분 소요, 세포는 다음 하루에 한 번 모니터링하는현미경, 미디어 2-3 일마다 부착과 세포의 파생물 후 변경됩니다.

각질 박리 후 48 시간 자마자 생검 조각의 성장. 처음으로 섬유 아세포의 파생물은 주일 정도 처리 한 후 관찰 할 수있다. 우물 confluency에 도달하면, 섬유 아세포는 세 150cm 플라스크 (T150)에 도달하기 위해 두 개 더 구절에 대한 계대하고 세포를 냉동 보존됩니다. 우리는이 방법 15-20000000 세포를 생성합니다. 섬유 아세포는 소포체로 번역 콜라겐 특정 분자 보호자입니다 안티 SERPINH1 (또한 HSP-47라고도...

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Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

인간의 피부 펀치 생검에서 섬유 아세포의 절편 배양 프로토콜은 낮은 통로 번호로 만 15-20 세포 은행을위한 4-8 주 이내에 피부 세포를 유도하기 위해 기술적으로 강력하고 간단한 방법입니다.

인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

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인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

연구

의학

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

파킨슨 병 분야에서 Mitochondrial Phenotypes을 모니터링하기위한 기본 인간 섬유 아세포의 사용

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

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