Name: skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

Utvikling av denne protokollen ble finansiert av California Institute for regenerativ medisin (CIRM, TR1-01246) og Parkinsons Alliance.

Huden punch biopsi innhentet ved hjelp av standard prosedyre 3 (dvs. oppnådd med 4mm runde Visipunch instrument) bør holdes i fullstendig DMEM 20% FBS media på is. Når prøven er ankommet i laboratoriet, behandle biopsi så snart som mulig. En. Klargjøring av Skin Punch Biopsi TRINN 01.01 til 01.03 skal utføres inne i en biosikkerhet CABINET <ol><li> Forbered på forhånd: Tilsett 1 ml 0,1% Gelatin til hver brønn i en...

<ol>
	<li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress.">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li><li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson's+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication.">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li><li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=biopsy+of+the+skin.">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).</li><li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin+embedded+tissue+specimens.">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li></ol>

Med denne protokollen, kan relativt rene kulturer av hudfibroblaster oppnås. Fibroblaster har karakteristiske morfologiske trekk ved langstrakte, spindel-lignende celle organer, runde til ovale cellekjerner, og fibroblaster vokse justert og i bunter når konfluent. Mediene støtter veksten av fibroblaster, mens andre celle populasjoner f.eks keratinocytes trenger ekstra tilskudd og vekstfaktorer, eller er mitotisk mindre aktive, gjør dette for relativt rene fibroblastkulturer. Fib...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>S6E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 cm Tissue Culture Petri dish</td>
 <td>VWR</td>
 <td>25382-166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well Tissue Culture plate </td>
 <td>VWR</td>
 <td>73520-906</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21909-660</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile pointed-tip forceps</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 mL Conical tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-940</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-894</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-896</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>14672-380</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Table A. Table of specific reagents and equipments.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent</td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X DMEM: High Glucose</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11960-069</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20% Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>26140-079</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>25030-164</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X MEM Non-essential Amino Acids </td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11140-076</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>15140-163</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table B. Reagents.

skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts

Vev og cellelinjer som stammer fra en person med sykdommen er ideelle kilder for å studere sykdomsrelaterte cellulære fenotyper. Pasient-avledet fibroblaster i denne protokollen har blitt brukt i avledning av induserte pluripotente stamceller til modell sykdom 1. Tidlige passasjer i disse fibroblaster kan også brukes for celle-baserte funksjonelle analyser for å studere bestemte sykdom trasé, mekanismer 2 og påfølgende drug screening tilnærminger. Fordelen med den presenterte protokollen over enzymatiske prosedyrer er 1) at reproduserbarheten av teknikken fra små mengder vev avledet fra eldre pasienter, for eksempel pasienter som lider av Parkinsons sykdom, 2) den teknisk enkel tilnærmingen over mer krevende metoder ved hjelp av enzymatiske behandlinger, og tre ) tiden betraktning: denne protokollen tar 15-20 min og kan utføres umiddelbart etter biopsi ankomst. Enzymatiske behandlinger kan ta opp til 4 timer, og har problemene medoverdigestion, reduksjon av cellenes levedyktighet og påfølgende binding av cellene når de ikke behandles på riktig måte. Denne protokollen beskriver disseksjon og utarbeidelse av et 4-mm menneskelig hud biopsi for avledning av en fibroblast kultur og har en svært høy suksessrate som er viktig når du arbeider med pasient-avledet vevsprøver. I denne kulturen, keratinocytter migrere ut av vevsprøver løpet av den første uke etter fremstilling. Fibroblaster vises 7-10 dager etter den første utvekst av keratinocytter. DMEM høy glukose media supplert med 20% FBS favoriserer veksten av fibroblaster løpet keratinocytter og fibroblaster vil overgrow keratinocytter. Etter to passasjer keratinocytes har blitt utvannet ut som resulterer i relativt homogene fibroblastkulturer som uttrykker fibroblast markør SERPINH1 (HSP-47). Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan 15 til 20 millioner fibroblaster utledes i 4-8 uker for cellen banktjenester. Huden disseksjon tar omtrent 15-20 minutter, blir cellene deretter fulgt en gang om dagenunder mikroskopet, og media er endret etter 2-3 dager etter tilknytning og utvekst av celler.

Keratinocytter vokser ut av biopsi stykker så snart 48 timer etter disseksjon. Først fibroblaster utvekst kan observeres om en uke etter behandling. Når brønnene har nådd confluency, er fibroblaster passaged for to passeringer å nå tre 150 cm kolber (T150) og cellene blir cryopreserved. Vi generere med denne metoden 15 til 20 millioner celler. Den fibroblaster er positive for anti-SERPINH1 (også kjent som HSP-47) (figur 1), som er en kollagen-spesifikk molekylærprobe anstand lokalisert i det en...

Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Den fibroblast explant kultur protokoll fra human hud slag biopsier er en teknisk robust og enkel måte for å utlede hudceller innen 4-8 uker for banking av ca 15-20 millioner celler ved en lav passasje nummer.

Skin Punch Biopsi Eksplantering Kultur for Utledning av primære humane fibroblaster

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Eksperimentell Generation of Karsinom-Associated Fibroblaster (kafeer) fra Human mammary Fibroblaster

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Bruk av primære humane fibroblaster for overvåking Mitokondrielle Fenotyper i feltet av Parkinsons sykdom

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse colontumorer

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

En Tredimensjonal Tissue Culture modell for å studere Primær Menneskelig Bone Marrow og dets Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primær Culture of Human Vestibulær schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified BergstrÃƒÆ’Ã‚Â¶m Technique

Menneskelige skjelettmuskelbiopsi prosedyrer ved hjelp av endret Bergström Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Etablering av Menneskelig Epithelial Enteroids og Colonoids fra Whole Tissue og Biopsi

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Menneskelig<em&gt; vastus lateralis</em&gt; Skeletal Muscle Biopsi Bruke Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Karakterisering etter en ny Disaggregering metode for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tredimensjonal Alginat-perle Culture of Human hypofyseadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...