Name: skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

Utvecklingen av detta protokoll har finansierats av California Institute för regenerativ medicin (CIRM, TR1-01246) och Parkinsons Alliance.

Huden stansbiopsi erhålls genom standardiserade procedur 3 (t.ex. erhållas med 4mm rund Visipunch instrument) bör hållas i fullständigt DMEM 20% FBS media på is. När provets anlänt i laboratoriet, bearbeta biopsi så snart som möjligt. Ett. Beredning av Skin stansbiopsi STEG 1,1-1,3 SKA utföras inne i en biosäkerhet skåp <ol><li> Förbered i förväg: Lägg 1 ml av 0,1% gelatin till varje brunn i en 6-brunnar. St...

<ol>
	<li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress.">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li><li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson's+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication.">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li><li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=biopsy+of+the+skin.">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).</li><li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin+embedded+tissue+specimens.">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li></ol>

Med detta protokoll kan relativt rena kulturer av hudfibroblaster erhållas. Fibroblasterna har karakteristiska morfologiska drag av långsträckta, spindel-liknande cell organ, runda till ovala cellkärnor, och fibroblaster växer i linje och i buntar när sammanflytande. Medierna stöder tillväxten av fibroblaster medan andra cellpopulationer ex keratinocyter behöver ytterligare tillskott och tillväxtfaktorer, eller är mitotiskt mindre aktiva, gör detta för relativt rena fibroblastkulturer. <p class...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>S6E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 cm Tissue Culture Petri dish</td>
 <td>VWR</td>
 <td>25382-166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well Tissue Culture plate </td>
 <td>VWR</td>
 <td>73520-906</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21909-660</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile pointed-tip forceps</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 mL Conical tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-940</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-894</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-896</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>14672-380</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Table A. Table of specific reagents and equipments.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent</td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X DMEM: High Glucose</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11960-069</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20% Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>26140-079</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>25030-164</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X MEM Non-essential Amino Acids </td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11140-076</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>15140-163</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table B. Reagents.

skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts

Vävnader och cellinjer som härrör från en individ med sjukdomen är perfekta källor för att studera sjukdomsrelaterade cellulära fenotyper. Patient-härledda fibroblaster i detta protokoll har framgångsrikt använts vid härledningen av inducerade pluripotenta stamceller till modellen sjukdom 1. Tidiga passager av dessa fibroblaster kan också användas för cellbaserade funktionella analyser för att studera specifika sjukdomsmekanismer, mekanismer 2 och efterföljande terapier strategier screening. Fördelen med den presenterade protokoll över enzymatiska förfaranden 1) reproducerbarhet av tekniken från små mängder av vävnad som härrör från äldre patienter, t.ex. patienter som drabbats med Parkinsons sjukdom, 2) den tekniskt enkel metod över mer utmanande metoder använder enzymatiska behandlingar, och 3 ) den tid beaktas: detta protokoll tar 15-20 minuter och kan utföras omedelbart efter biopsi ankomst. Enzymatiska behandlingar kan ta upp till fyra timmar och har problemen medoverdigestion, minskning av cellernas livskraft och efterföljande fastsättning av celler när de inte hanteras på rätt sätt. Detta protokoll beskriver dissekering och beredningen av ett 4-mm human hudbiopsi för härledning av en fibroblast kultur och har en mycket stor framgång, som är viktigt när det handlar om patienter-härledde vävnadsprover. I denna kultur, keratinocyter migrerar ut från biopsivävnad inom den första veckan efter beredning. Fibroblaster visas 7-10 dagar efter första utväxt av keratinocyter. DMEM höga glukos-medium kompletterat med 20% FBS gynnar tillväxten av fibroblaster över keratinocyter och fibroblaster kommer växa över de keratinocyter. Efter 2 passager keratinocyter har spätts ut vilket resulterar i relativt homogena fibroblastkulturer som uttrycker SERPINH1 fibroblast markör (HSP-47). Med denna metod kan ca 15-20 miljoner fibroblaster härledas i 4-8 veckor för cell banking. Huden dissektion tar ca 15-20 min, celler övervakas därefter en gång om dagenunder mikroskop, och media byts var 2-3 dagar efter fastsättning och utväxt av celler.

Keratinocyter växer ur biopsi bitar så snart som 48 timmar efter dissektion. Första fibroblaster utväxt kan observeras om en vecka efter bearbetning. När brunnarna har nått sammanflytande, är fibroblaster passerats för två ytterligare passager för att nå tre 150 cm kolvar (T150) och celler kryobevarades. Vi skapar med denna metod ca 15-20 miljoner celler. Fibroblasterna är positiva för anti-SERPINH1 (även känd som HSP-47) (Figur 1), som är en kollagen-specifik molekylär chaperon lokalis...

Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Den fibroblaster Explantation kultur protokollet från humana biopsier huden punch är en tekniskt robust och enkelt sätt att härleda hudceller inom 4-8 veckor för bank på ca 15-20 miljoner celler på en låg passage nummer.

Skin stansbiopsi Explantationsersättning Kultur för Derivering av primära humana fibroblaster

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Experimentell generationens Cancer Associated-fibroblasts (CAFS) från Human bröst fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Användning av primära humana fibroblaster för övervakning Mitokondriella fenotyper inom området för Parkinsons sjukdom

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro organoid Kultur av primära tumörer musändtarm

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

En Tredimensionell Tissue Culture modell för att studera Primary humana benmärg och dess Maligniteter

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primär kultur av Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified BergstrÃƒÆ’Ã‚Â¶m Technique

Human Skeletal Muscle Prov Använda Modified Bergström Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Etablering av Human Epithelial Enteroids och Colonoids från Whole Tissue och biopsi

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Mänsklig<em&gt; vastus lateralis</em&gt; Skeletal muskelbiopsi Använda Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Characterization efter en ny Disaggregation metod för Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tredimensionell alginat-pärla Culture of Human hypofysadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...