Name: skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

Bu protokolün geliştirilmesi Rejeneratif Tıp California Institute (CIRM, TR1-01246) ve Parkinson Alliance tarafından finanse edildi.

Punch biyopsi, Standart Prosedür 3&#39;e (örneğin 4 mm yuvarlak Visipunch cihazı ile elde edilmiş) kullanılarak elde edilen cilt buz üzerinde tam DMEM% 20 FBS ortamı içinde tutulmalıdır. Bir kez örnek laboratuarda geldi, en kısa zamanda biyopsi işlemek. 1. Cilt Punch Biyopsi hazırlanması ADIMLAR 1,1-1,3 A BİYOGÜVENLİK CABINET İÇ YAPILACAK OLAN <ol><li> Önceden hazırlayın: 6-kuyulu plakanın her kuyuya...

<ol>
	<li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress.">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li><li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson's+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication.">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li><li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=biopsy+of+the+skin.">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).</li><li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin+embedded+tissue+specimens.">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li></ol>

Bu protokol ile, deri fibroblast nispeten saf kültürleri elde edilebilir. Fibroblastlar oval hücre çekirdekleri yuvarlak uzun, iğ gibi hücre gövdeleri, karakteristik morfolojik özelliklere sahip, ve ne zaman birleşik fibroblast uyumlu ve demetleri büyür. Medya fibroblast büyüme örneğin keratinositler ilaveler ve büyüme faktörleri gerekir, ya da mitotik daha az aktif olan diğer hücre popülasyonlarının ise, bu nispeten saf fibroblast kültürleri sağlar destekler. <p class="jove_conten...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>S6E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 cm Tissue Culture Petri dish</td>
 <td>VWR</td>
 <td>25382-166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well Tissue Culture plate </td>
 <td>VWR</td>
 <td>73520-906</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21909-660</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile pointed-tip forceps</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 mL Conical tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-940</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-894</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-896</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mL Serological Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89130-898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>14672-380</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Table A. Table of specific reagents and equipments.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent</td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X DMEM: High Glucose</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11960-069</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20% Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>26140-079</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>25030-164</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X MEM Non-essential Amino Acids </td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>11140-076</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen/Gibco</td>
 <td>15140-163</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table B. Reagents.

skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts

Hastalığı olan bir bireyden elde edilen dokular ve hücre çizgileri, hastalıkla ilişkili hücre fenotipleri çalışma yapmak için ideal kaynaklarıdır. Bu protokolde Hasta elde edilen fibroblast başarılı modeli hastalığı 1 ile uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetme kullanılmaktadır. Bu fibroblastlar erken geçişleri de belirli bir hastalık yolları mekanizmaları 2 ve daha sonraki ilaç tarama yaklaşımı incelemek için hücre bazlı fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Enzimatik prosedürler üzerinde Sunulan protokol avantajı 1) enzimatik tedaviler kullanarak yaşlı hastalar, Parkinson hastalığı, 2 ile etkilenen hastalarda) daha zor metodolojileri fazla teknik olarak basit bir yaklaşım türetilen doku küçük miktarlarda tekniğinin yeniden üretimde kıtlık ve 3 vardır ) zaman göz: Bu protokol 15-20 dakika sürer ve biyopsi geldikten sonra hemen yapılabilir. Enzimatik tedaviler 4 saat kadar sürebilir ve sorunları olabilirhücre canlılığı ve doğru kullanılmadığında hücrelerin sonraki ekin Overdigestion, azaltılması. Bu protokol, 4 mm insan derisi bir fibroblast kültür türetme için biyopsi diseksiyon ve hazırlık açıklar ve hasta kaynaklı doku örnekleri ile uğraşırken önemli olan çok yüksek başarı oranına sahiptir. Bu kültürde, keratinositler hazırlandıktan sonra ilk hafta içinde biyopsi doku dışına göç. Fibroblast keratinositlerin ilk akıbet sonra 7-10 gün görünür. % 20 FBS ile takviye DMEM yüksek glukoz medya keratinositlerin ve fibroblastların üzerinde fibroblast büyüme keratinositleri büyümek olacak yanadır. 2 pasajlar sonra keratinositler fibroblast işaretleyici SERPINH1 (HSP-47) ifade nispeten homojen fibroblast kültürlerinde neden dışarı seyreltilmiş edilmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, da 15-20 milyon fibroblast hücre bankacılığı için 4-8 hafta içinde elde edilebilir. Cilt diseksiyonu 15-20 dakika sürer, hücreler daha sonra günde bir kez izlenirmikroskop altında, ve medya 2-3 günde bağlanma ve hücre akıbet sonra değiştirilir.

Keratinositler diseksiyonu sonra 48 saat gibi kısa sürede biyopsi parçaları dışında büyüyen. İlk fibroblast akıbet yaklaşık bir hafta işleme sonra görülebilir. Kuyu konfluense ulaştığında, fibroblastlar üç 150 cm şişeleri (T150) ulaşmak için iki veya daha fazla geçit olarak tatbik edilir ve hücreler dondurulup saklanır. Bu yöntem 15-20.000.000 hücreleri ile üretir. Fibroblastlar, endoplazmik retikulum lokalize bir kollajen spesifik moleküler şaperon anti-SERPINH1 (ayrıca HSP-47 olarak ...

Watch this Scientific Journal Video about Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts at JoVE.com

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Insan derisi punch biyopsi gelen fibroblast eksplant kültür protokolü düşük bir geçit numaradan milyon 15-20 hücre bankacılığı için 4-8 hafta içinde cilt hücrelerini elde etmek teknik olarak sağlam ve basit bir yoludur.

İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

İnsan Vestibüler Schwannomalar İlköğretim Kültürü

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified BergstrÃƒÆ’Ã‚Â¶m Technique

Modifiye Bergström Tekniği İnsan İskelet Kası Biyopsi Prosedürleri

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

İnsan<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; Weil-Blakesley Conchotome kullanılması İskelet Kası Biyopsi

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...