Name: spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00
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Cette étude a été financée par le NIH financement de la recherche (DK090868 et GM092930 à TI). Il ya une attente de brevet sur un analogue de la rapamycine en cage.

1. La transfection de l&#39;ADN plasmidique <ol><li> Ajouter ADN plasmidiques, 0,5 ug membrane captif FRB (ci-après dénommé LDR) et 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cell invasion lymphome et les métastases induisant la protéine 1: Rac activateur) marqué avec la protéine fluorescente à 37,5 pi dH 2 O. Ajouter 1 ul FuGENE HD. </li><li> Vortex et incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Pendant ce temps, procéder aux étapes 1,3-1,8. </li><li> Laver chaque puits d&#39;une chambre de 8 puits avec 50 pl...

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	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. 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C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

Nous avons décrit une technique qui emploie un roman composé en cage avec le système hétérodimérisation FKBP-FRB afin de manipuler Rho GTPase activité à un endroit précis sur une échelle subcellulaire de temps en secondes. Il ya trois limites de l&#39;approche actuelle. Tout d&#39;abord, parce que la méthode est basée sur la prévention ou permettant la diffusion des dimérisation travers la membrane plasmique, l&#39;emplacement cible cellulaire doit être la membrane plasmique o...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / équipements </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> La rapamycine </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidine </td><td> Sigma </td><td> A9275-10MG </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Taille-exclusion colonne </td><td> GE Healthcare </td><td> Piège Spin G-25 </td></tr><tr><td> À fond de verre de 8 puits de chambre </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Microscope inversé à fluorescence </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> LED UV source de lumière </td><td> Rapp Opto Electronics </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Confocale disque en rotation </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> 100x l `objectif </td><td> Zeiss </td><td> Plan Apochromat </td></tr></tbody></table> Schéma de synthèse du CRB (droit d&#39;auteur ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Schéma 1" /></a> Les conditions de synthèse: (a) BnBr, K 2 CO 3, du DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) TFA (d) propargyl-Br, K 2 CO 3, du DMF, (e) glycérol, le chat. pTSA, toluène (f) NaBH 3 CN, TiCl 4, MeCN (g) Tf 2 O, pyridin méthanol (h) HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, pyridine, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH 2 Cl 2 (m) 13, CuSO 4, ascorbate, le 2-propanol, H 2 O, CH 2 Cl 2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

Régulation dynamique de la famille Rho guanosine triphosphatases petites GTPases) avec une précision spatio-temporelle est grande essentiels pour diverses fonctions cellulaires et des événements 1, 2. Leur nature spatio-temporelle dynamique a été révélé par la visualisation de leur activité et la localisation en 3 temps réel. Afin d&#39;obtenir une meilleure compréhension de leurs rôles dans diverses fonctions cellulaires au niveau moléculaire, la prochaine étape devrait être la perturbation des activités de protéines à un endroit précis subcellulaire et le calendrier. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé une méthode pour induite par la lumière, spatio-temporellement activation contrôlée de petites GTPases en combinant deux techniques: (1) rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et (2) une méthode de photo-mise en cage de la rapamycine. Avec l&#39;utilisation de la rapamycine-FKBP-FRB médiation hétérodimérisation, nous avons développé une méthode pour rapidement inductible activation ou l&#39;inactivation des petites GTPases including Rac 4, Cdc42 4, 4 RhoA et Ras 5, dans lequel la rapamycine induit la translocation de la FKBP-condensés, ou leurs GTPases activateurs, à la membrane plasmique, où FRB est ancré. Pour le couplage avec ce système hétérodimérisation, nous avons également développé un système de photo-mise en cage de la rapamycine analogues. Un composé photo-cage est une petite molécule dont l&#39;activité est supprimée avec un groupe photoclivable protéger connu sous le nom d&#39;un groupe de mise en cage. Pour supprimer l&#39;activité hétérodimérisation complètement, nous avons conçu une rapamycine en cage qui est attaché à une macromolécule de telle sorte que le complexe résultant grande ne peut pas traverser la membrane plasmique, ce qui conduit à pratiquement aucune activité de fond comme une dimérisation chimique à l&#39;intérieur des cellules 6. Figure 1 illustre un schéma de notre système. Avec la combinaison de ces deux systèmes, nous recrutés localement un activateur de Rac à la membrane plasmique sur une échelle de temps de quelques secondes et atteint induite par la lumière d&#39;activation Rac à la subcellulaire level 6.

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Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Procédé pour spatio-temporel de commande de l&#39;activité GTPase de petite par la lumière est décrite. Cette méthode est basée sur la rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et photo-cages systèmes. Optimisation de la lumière-l&#39;irradiation permet l&#39;activation spatio-temporellement contrôlée de petites GTPases au niveau subcellulaire.

Spatio-temporelle de manipulation de l&#39;activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Perles de séparation et les cellules dans des dispositifs microfluidiques multi-canal en utilisant diélectrophorèse et à flux laminaire

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Recherche

Bio-ingénierie

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Imagerie de vie de fluorescence des rotors moléculaires dans les cellules vivantes

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l&#39;oxygène à l&#39;Islet Plain

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

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Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

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A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Une technique Label-free pour l&#39;imagerie spatio-temporelle de cellule unique sécrétions

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Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

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Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

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Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour capturer des Images 4-dimensionnelle des effets de modulation de la contrainte de cisaillement sur le coeur de poisson-zèbre en développement

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

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