Name: spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00
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Diese Studie wurde vom NIH Forschungsförderung (DK090868 und GM092930 zu TI) unterstützt. Es gibt eine schwebende Patentanmeldungen auf einem Käfig Rapamycinanalog.

1. Die Transfektion von Plasmid-DNA <ol><li> In Plasmid-DNA, 0,5 ug Membran-gebundenen FRB (nachstehend bezeichnet LDR) und 0,5 ug FKBP-TIAM1 (T-Zell-Lymphom Invasion und Metastasierung-induzierenden Proteins 1: Rac Aktivator) mit fluoreszierendem Protein auf 37,5 ul dH 2 O markiert Fügen Sie 1 ul FuGENE HD. </li><li> Vortex und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Inzwischen, um Schritte von 1,3 bis 1,8 gehen. </li><li> Waschen Sie jede Vertiefung eines 8-Well-Kammer mit 50 ul Poly-D-Lysin. </li...

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	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

Wir beschrieben eine Technik, die eine neuartige Verbindung Käfigen beschäftigt zusammen mit dem FKBP-FRB Heterodimerisierung System, um Rho GTPase-Aktivität zu einem bestimmten subzellulären Ort auf einer Zeitskala von Sekunden zu manipulieren. Es gibt drei Einschränkungen des vorliegenden Ansatzes. Erstens, weil das Verfahren zur Verhinderung oder die Diffusion von Dimerisierer über die Plasmamembran basiert, muss das Ziel zelluläre Lokalisation die Plasmamembran oder deren Umgebung...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Rapamycin </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidin </td><td> Sigma </td><td> A9275-10MG </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Größenausschlußsäule </td><td> GE Healthcare </td><td> Spin-Trap-G-25 </td></tr><tr><td> Glasboden 8-Well-Kammer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Invertierten Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV-LED-Lichtquelle </td><td> Rapp Opto Electronics </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Konfokale drehende Scheibe </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> 100x Objektiv </td><td> Zeiss </td><td> Plan Apochromat </td></tr></tbody></table> Syntheseschema der CRB (Copyright ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Schema 1" /></a> Synthetische Bedingungen: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) Glycerin, Katze. PTSA, Toluol (f) NaBH 3 CN, TiCl 4, MeCN (g) Tf 2 O, Pyridin (h) Methanol-HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, Pyridin, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-Di-t-Butylpyridin, CH 2 Cl 2 (m) 13, CuSO 4, Ascorbat, 2-Propanol, H 2 O, CH 2 Cl 2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

Dynamischen Regulation der Rho-Familie kleiner Guanosin Triphosphatasen (GTPasen) mit großer Präzision raumzeitlichen ist essentiell für verschiedene zelluläre Funktionen und Ereignisse 1, 2. Ihre raumzeitlich dynamische Natur wurde durch Visualisierung der ihre Aktivität und Lokalisierung in Echtzeit 3 enthüllt worden. Um ein tieferes Verständnis ihrer Rollen in diversen zellulären Funktionen auf molekularer Ebene zu gewinnen, sollte der nächste Schritt Störung der Protein-Aktivitäten sein, an einer präzisen subzelluläre Ort und Zeitpunkt. (1) Rapamycin-FKBP-induzierte FRB Heterodimerisierung und (2) ein Foto einschließende Verfahren Rapamycin: Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir ein Verfahren zur lichtinduzierten, räumlich-zeitlich kontrollierte Aktivierung der kleinen GTPasen durch Kombinieren von zwei Techniken entwickelt. Mit der Verwendung von Rapamycin-FKBP-vermittelte Heterodimerisierung FRB, haben wir ein Verfahren zur schnellen induzierbare Aktivierung oder Inaktivierung der kleinen GTPasen includi entwickeltng Rac 4, Cdc42 4, RhoA 4 und Ras 5, bei dem Rapamycin induziert Translokation von FKBP-kondensierten GTPasen, oder deren Aktivatoren, der Plasmamembran, wo FRB verankert ist. Für die Kopplung mit diesem Heterodimerisierung System haben wir auch ein Foto-Käfighaltung von Rapamycin-Analoga-System entwickelt. Ein Foto-caged Verbindung ist ein kleines Molekül, dessen Aktivität mit einem photospaltbaren Schutzgruppe als Käfighaltung Gruppe bekannt unterdrückt. Um Heterodimerisierung Aktivität vollständig zu unterdrücken, haben wir ein Käfig Rapamycin, die an ein Makromolekül, so dass die daraus resultierende große Komplex kann nicht über die Plasmamembran gebunden wird, was zu praktisch ohne Hintergrund-Aktivität als eine chemische Dimerisierer innerhalb der Zellen 6. Abbildung 1 zeigt ein Schema unserer System. Mit der Kombination dieser beiden Systeme haben wir vor Ort rekrutierten eine RAC-Aktivator zur Plasmamembran auf einer Zeitskala von Sekunden und erreicht durch Licht induzierten Rac-Aktivierung an der subzellulären levEL 6.

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Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Verfahren zum räumlichen-zeitlichen Steuerung der GTPase-Aktivität durch Licht beschrieben. Dieses Verfahren basiert auf Rapamycin-FKBP-induzierte FRB Heterodimerisierung und Foto einschließende Systeme. Optimierung der Licht-Bestrahlung ermöglicht die raum-zeitlich kontrollierte Aktivierung der kleinen GTPasen auf subzellulärer Ebene.

Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Forschung

Biotechnik

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Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

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Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

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