Name: spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי NIH מחקר מימון (DK090868 ו GM092930 ל TI). יש פטנט על אנלוגי rapamycin בכלוב.

1. Transfection של DNA פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DNAs פלסמיד, 0.5 קרום קשור מיקרוגרם FRB (להלן: LDR) ו -0.5 מיקרוגרם FKBP-Tiam1 (T-cell לימפומה הפלישה גרורות-התרמה חלבון 1: RAC activator) מתויג עם חלבון פלואורסצנטי כדי μl 37.5 DH 2 א &#39; הוסף 1 μl FuGENE HD. </li><li style=";text-align...

<ol>
	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light.">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li><li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

תיארנו טכניקה המשתמשת רומן בכלוב המתחם יחד עם מערכת FKBP-FRB heterodimerization כדי לתפעל פעילות Rho GTPase במיקום subcellular מדויק בקנה מידה זמן של שניות. יש שלוש מגבלות הגישה הנוכחית. ראשית, כי השיטה מבוססת על מניעת או לאפשר דיפוזיה של dimerizer דרך הממב?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Rapamycin </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> רוש </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidin </td><td> סיגמא </td><td> A9275-10 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> סיגמא </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> גודל הדרה עמודה </td><td> GE Healthcare </td><td> ספין מלכודת G-25 </td></tr><tr><td> תחתית זכוכית 8-גם קאמרית </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV-LED כמקור אור </td><td> ראפ Opto אלקטרוניקה </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> דיסק מסתובב confocal </td><td> Yokogawa החשמל </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> העדשה המטרה 100x </td><td> Zeiss </td><td> תוכנית Apochromat </td></tr></tbody></table> תוכנית סינתטית של CRB (כל הזכויות שמורות ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="תוכנית 1" /></a> תנאי סינתטיים: (א) BnBr, K 2 CO 3, DMF (ב) f.HNO 3, AcOH (ג) TFA (ד) Propargyl-BR, K 2 CO 3, DMF, (ה), חתול גליצרול. pTsA, טולואן (ו) CN 3 NaBH, TiCl 4, MeCN (ז) TF 2 O, Pyridin (ח) מתנול HCl, (אני) LiAlH 4, THF (י) TsCl, פירידין, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (L) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH 2 Cl 2 (מ) 13, CuSO 4, ascorbate, 2-propanol, H 2 O, CH 2 Cl 2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

ויסות דינאמי של משפחת רו של triphosphatases guanosine קטנים (GTPases) עם דיוק רב spatiotemporal חיוני לתיפקוד התאי ואירועים שונים 1, 2. הדינאמיות spatiotemporally שלהם נחשף על ידי הדמיה של פעילות שלהם לוקליזציה ב 3 בזמן אמת. על מנת לקבל הבנה עמוקה יותר של תפקידם תפקודים תאיים שונים ברמה המולקולרית, הצעד הבא צריך להיות הפרעה של פעילות חלבון במקום העיתוי subcellular מדויק. כדי להשיג מטרה זו, פיתחנו שיטה קלה הנגרמת, spatio-temporally הפעלה מבוקרת של GTPases קטנות על ידי שילוב של שתי טכניקות: (1) rapamycin הנגרמת FKBP-FRB heterodimerization ו (2) שיטת צילום caging של rapamycin. עם השימוש heterodimerization FKBP-FRB rapamycin בתיווך, פיתחנו שיטה מהירה מושרה ההפעלה או איון של קטן GTPases including RAC 4, 4 Cdc42, RhoA 4 ו 5 ראס, שבו rapamycin גורם טרנסלוקציה של FKBP-התמזגו GTPases או activators שלהם, קרום הפלזמה שבו FRB מעוגן. עבור צימוד עם מערכת זו heterodimerization, פיתחנו גם מערכת צילום caging של אנלוגים rapamycin. מתחם צילום בכלוב היא מולקולה כימית קטנה, אשר הפעילות מדוכאת עם קבוצת הגנה photocleavable הידועה כקבוצה caging. כדי לדכא את פעילות heterodimerization לחלוטין, עיצבנו rapamycin בכלוב כי הוא קשור מקרומולקולה כך מורכבת גדול וכתוצאה מכך אינו יכול לחצות את הממברנה הפלסמטית, המוביל פעילות כמעט ללא רקע כמו dimerizer כימי בתוך התאים 6. איור 1 מדגים התוכנית שלנו המערכת. עם שילוב של שתי מערכות אלו, אנו מקומי גייס activator RAC קרום הפלזמה על זמנים של שניות והשיג אור הנגרמת ההפעלה RAC על לב subcellularאל 6.

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

שיטה לשליטה במרחב ובזמן פעילות GTPase קטן לאור המתואר. שיטה זו מבוססת על heterodimerization FKBP-FRB rapamycin הנגרמת צילום-caging מערכות. אופטימיזציה של הקרנת אור מאפשר הפעלה מבוקרת spatio-temporally של GTPases קטנים ברמה subcellular.

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

חרוזים ועל הפרדת תאים ריבוי ערוצים מכשירים microfluidic שימוש dielectrophoresis ו זרימה למינרית

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

בקרה כמותי וזמנית של Microenvironment חמצן ברמה יחיד Islet

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...