Name: spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00
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本研究では、NIHの研究資金（TIへDK090868とGM092930）によってサポートされていました。ケージラパマイシンアナログの保留中の特許があります。

1。プラスミドDNAのトランスフェクション<ol><li>プラスミドDNAを追加し、0.5μgの膜係留FRB（以下、LDRと呼ばれる）と0.5μgのFKBP-Tiam1（T-細胞リンパ腫の浸潤や転移を誘発するタンパク質1：RAC活性剤）37.5μLのdH 2 Oに蛍光タンパク質でタグ付け1μlのトランスフェHDを追加します。 </li><li> 20分間室温でボルテックスし、インキュベートします。一方、ステップ1.3から1.8に進みます。 </li><li> ...

<ol>
	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light.">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li><li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

我々は、秒の時間スケールでの正確な細胞内の場所でのRho GTPase活性を操作するために、FKBP-FRBヘテロシステムと小説ケージド化合物を一緒に採用してテクニックを説明します。 現在のアプローチの3つの制約があります。方法は、プラズマ膜を横切ってdimerizerの拡散を防止または許可に基づいているので、まず、ターゲット細胞の位置は、原形質膜またはその付近である?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/装置の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ラパマイシン</td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td>トランスフェHD </td><td>ロシュ社</td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td>アビジン</td><td>シグマ</td><td> A9275-10mgの</td></tr><tr><td> DMSO </td><td>シグマ</td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td>サイズ排除カラム</td><td> GEヘルスケア</td><td>スピントラップG-25 </td></tr><tr><td>ガラス底8ウェルチャンバー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td>紫外線LED光源</td><td>ラップオプトエレクトロニクス</td><td> UVILED </td></tr><tr><td>共焦点回転するディスク</td><td>横河電機（株） </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>浜松ホトニクス</td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> 100倍対物レンズ</td><td>ツァイス</td><td>プランアポクロマート</td></tr></tbody></table> CRBの合成スキーム（著作権ACS2011）6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="スキーム1" /></a> 合成条件：（a）BnBr、K 2 CO 3、DMF（b）にf.HNO 3、AcOHで（c）にTFA（d）のプロパルギル-Brを、K 2 CO 3、DMF、（e）のグリセロールは、猫。 PTSA、トルエン（F）のNaBH 3 CN、TiCl 4の 、MeCN中（G）のTf 2 O、ピリジン（h）のメタノール塩酸は、（i）のLiAlH 4、THF（J）TSCL、ピリジンのCH 2 Cl 2（K）はNaN 3、DMF（L）8、2,6 -ジ-t-ブチル、CH 2 Cl 2中 （M）13日のCuSO 4、アスコルビン酸、2 -プロパノール、H 2 O、CH 2 Cl 2で 。

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

大きな時空間精度で小さなグアノシントリホスファターゼのRhoファミリー（GTPアーゼ）の動的な制御は、様々な細胞機能やイベントの1、2のために不可欠です。その時空の動的な性質は、リアルタイム3それらの活性と局在の可視化によって明らかにされています。分子レベルでの多様な細胞機能における役割のより深い理解を得るために、次のステップは、正確な細胞内局在場所とタイミングでタンパク質の活動の摂動である必要があります。 （1）ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロおよびラパマイシン（2）写真ケージング方法：この目標を達成するために、我々は、光誘起、二つの手法を組み合わせることにより、低分子量GTPaseの時空間、時間的に制御されたアクティベーションの方法を開発した。ラパマイシン媒介FKBP-FRBのヘテロを使用すると、我々は急速に低分子量GTPase includiの活性化または不活性化を誘導するための方法を開発しましたngのRAC 4、ラパマイシンは、FRBが固定されている細胞膜に、FKBP-融合GTPアーゼ、またはそれらの活性化の移行を誘導するCdc42の4、RhoAの4とRasの5。このヘテロシステムと結合するために、我々はまた、ラパマイシン類似体の写真ケージシステムを開発した。写真ケージド化合物は、その活動ケージング基として知られている光開裂性保護基で抑制されている小分子である。完全にヘテロの活性を抑制するために、我々はセル6内の化学dimerizerとして事実上のバックグラウンド·アクティビティにつながる、結果として大規模な複合体が細胞膜を通過できないような高分子につながれているケージラパマイシンを設計しました。 図1は、我々のスキームを示していますシステム。これら二つのシステムの組み合わせにより、我々は局所的に数秒の時間スケールで形質膜へのRac活性化を採用し、細胞内レフで光誘起Racの活性化を達成しましたエル6。

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Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

光による小さなGTPase活性の時空間制御の方法が記載されている。このメソッドは、ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロと写真ケージシステムに基づいています。光照射の最適化は、細胞内レベルでの低分子量GTPaseの時空間時間的制御の活性化を可能にします。

生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Research

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