Name: spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Denne studien ble støttet av NIH forskningsmidler (DK090868 og GM092930 til TI). Det er en ventende patent på et inngjerdet rapamycin analog.

1. Transfeksjon av plasmid DNA <ol><li> Legg Plasmid DNAS, 0,5 mikrogram membran-tethered FRB (heretter referert til som LDR) og 0,5 _g FKBP-Tiam1 (T-celle lymfom invasjon og metastasering-induserende protein 1: Rac aktivator) merket med fluorescerende protein til 37,5 mL dH 2 O. Legg en mL FuGENE HD. </li><li> Vortex og Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter. I mellomtiden, fortsett til trinn 1.3-1.8. </li><li> Vask hver brønn av en åtte-brønns kammer med 50 mL poly-D-lysin. </li><li> Vask midten av hv...

<ol>
	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light.">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li><li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

Vi beskrev en teknikk som bruker en roman bur sammensatt sammen med FKBP-FRB heterodimerization system for å manipulere Rho GTPase aktivitet på en presis subcellulære sted på en tidsskala av sekunder. Det er tre begrensninger i denne tilnærmingen. For det første, fordi metoden er basert på å hindre eller tillate spredning av dimerizer over plasmamembranen, må målet mobilnettet sted å være plasma membran eller dens nærhet. Videre optimalisering av den kjemiske strukturen til CRB ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / utstyr </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Rapamycin </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidin </td><td> Sigma </td><td> A9275-10mg </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Størrelse-utelukkelse kolonne </td><td> GE Healthcare </td><td> Spin Trap G-25 </td></tr><tr><td> Glass bunn 8-brønn kammer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Inverted Fluorescensmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV LED lyskilde </td><td> Rapp Opto Electronics </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Confocal roterende disk </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD-kamera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> 100x Objective lens </td><td> Zeiss </td><td> Plan Apochromat </td></tr></tbody></table> Syntetisk ordningen med CRB (Copyright ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Scheme 1" /></a> Syntetiske forhold: (a) BnBr, K 2 3 CO, DMF (b) 3 f.HNO, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, 2 r 3 CO, DMF, (e) glyserol, katt. PTSA, Toluen (f) NaBH 3 CN, 4 TiCl, MeCN (g) Tf 2 O, Pyridin (h) metanol HCl, (i) 4 LiAlH, THF (j) TsCl, Vaseline, CH 2 2 Cl (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH 2 Cl 2 (m) 13, CuSO 4, askorbat, 2-propanol, H 2 O, CH 2 Cl 2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

Dynamisk regulering av Rho familien av små guanosine triphosphatases (GTPases) med stor spatiotemporal presisjon er viktig for ulike cellulære funksjoner og hendelser 1, 2. Deres spatiotemporally dynamiske natur er blitt avslørt av visualisering av sin aktivitet og lokalisering i sanntid tre. For å få dypere forståelse av sine roller i ulike cellulære funksjoner på molekylært nivå, bør neste skritt være endringen av protein aktiviteter på en presis subcellulære sted og tidspunkt. For å oppnå dette målet, har vi utviklet en metode for lys-indusert, spatio-timelig kontrollert aktivering av små GTPases ved å kombinere to teknikker: (1) rapamycin-indusert FKBP-FRB heterodimerization og (2) en foto-bur metode for rapamycin. Med bruk av rapamycin-mediert FKBP-FRB heterodimerization, har vi utviklet en metode for raskt induserbar aktivering eller inaktivering av små GTPases including 4 Rac, 4, Cdc42 4 RhoA og Ras 5, der rapamycin induserer translokasjon av FKBP-sammenvokste GTPases, eller deres aktivatorer, til plasmamembranen hvor FRB er forankret. For kopling med dette heterodimerization system, har vi også utviklet en foto-bur system av rapamycin analogs. Et bilde-bur forbindelsen er et lite molekyl hvis virksomhet er undertrykt med en photocleavable beskytte gruppe kjent som en bur gruppe. For å undertrykke heterodimerization aktivitet helt, designet vi et inngjerdet rapamycin som er bundet til en macromolecule slik at den resulterende store komplekset ikke kan krysse plasmamembranen, som fører til praktisk talt ingen bakgrunn aktivitet som en kjemisk dimerizer inni cellene 6. Figur 1 illustrerer en ordning med vår system. Med kombinasjonen av disse to systemene, vi lokalt rekruttert en Rac aktivator til plasmamembranen på en tidsskala av sekunder og oppnådde lysindusert Rac aktivering ved subcellulære level 6.

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

En metode for spatio-temporal kontroll av små GTPase aktivitet av lys er beskrevet. Denne metoden er basert på rapamycin-indusert FKBP-FRB heterodimerization og foto-merd systemer. Optimalisering av lys-bestråling muliggjør spatio-timelig kontrollert aktivering av små GTPases på subcellulære nivå.

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase aktivitet på subcellulære nivå og på Tidsskala sekunder i levende celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Fluorescens Lifetime Imaging of Molecular Rotorer i levende celler

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Kvantitativ og Temporal Kontroll av Oxygen mikromiljøet på Single Holme nivå

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolering av primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske vev og dyrking dem direkte på myke, elastiske Underlag for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

En etikett-fri teknikk for rom-tid-Imaging av enkeltcelle Sekret

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk Kontroll av levende celler elektrisk aktivitet ved Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur of Living mikrobiomer med mikro-oppbygd Menneskelig tarmtotter i en Gut-on-a-Chip mikrofluid Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering av Mesenchymal stamceller fra menneskelige Alveolar Periosteum og effekter av Vitamin D på Osteogenic aktivitet i Periosteum-avledet celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Lys arks fluorescens mikroskopi å ta 4-dimensjonale bilder av effektene av modulerende skjæring Stress på utvikle sebrafisk hjertet

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Måling av Force-Sensitive Protein dynamikk i levende celler ved hjelp av en kombinasjon av fluorescerende teknikker

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...