Name: spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Este estudo foi financiado pelo NIH o financiamento da investigação (DK090868 e GM092930 de TI). Existe uma patente pendente sobre um análogo rapamicina enjaulado.

1. A transfecção de DNA de plasmídeo <ol><li> Adicionar DNAs plasmídicos, 0,5 ug FRB membrana amarrado (daqui em diante referido como LDR) e 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cell lymphoma invasão e metástase indutora de proteína 1: Rac activador) marcado com proteína fluorescente para 37,5 uL dH 2 O. Adicionar 1 ml FuGENE HD. </li><li> Vortex e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos. Enquanto isso, vá para as etapas 1,3-1,8. </li><li> Lava-se cada poço de uma câmara de 8-bem com 50 uL de poli-D-li...

<ol>
	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light.">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li><li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

Nós descrevemos uma técnica que utiliza um novo composto engaiolados em conjunto com o sistema de heterodimerização FKBP-FRB, a fim de manipular Rho actividade GTPase a uma localização precisa subcelular numa escala de tempo de segundos. Há três limitações da presente abordagem. Em primeiro lugar, porque o método baseia-se na prevenção ou permitindo a difusão de dimerizer através da membrana plasmática, a localização do alvo celular necessita de ser membrana plasmática ou ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Rapamicina </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidina </td><td> Sigma </td><td> A9275-10MG </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Coluna de exclusão de tamanho </td><td> GE Healthcare </td><td> Giro Armadilha G-25 </td></tr><tr><td> Com fundo de vidro câmara de 8-bem </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência invertido </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV fonte de luz LED </td><td> Rapp Opto Eletrônica </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Disco giratório Confocal </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> Da Objectiva 100x </td><td> Zeiss </td><td> Apochromat Plano </td></tr></tbody></table> Esquema sintético do crb (Copyright ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Esquema 1" /></a> Condições sintéticas: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) TFA (d) propargil-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) gato glicerol,. PTSA, tolueno (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf 2 O, piridin (h) de metanol HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, piridina, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butilpiridina, 2 CH Cl 2 (m) 13, CuSO4, ascorbato, 2-propanol, H2O, CH 2 Cl 2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

Regulação dinâmica da família Rho de trifosfatases guanosina pequenas (GTPases) com precisão espaço-temporal grande é essencial para várias funções celulares e eventos 1, 2. A sua natureza dinâmica spatiotemporally foi revelada pela visualização da sua actividade e localização em tempo real 3. A fim de obter uma compreensão mais profunda dos seus papéis em diversas funções celulares a nível molecular, o próximo passo deve ser perturbação das actividades de proteína a uma localização precisa subcelular e de temporização. Para atingir este objectivo, desenvolvemos um método para a induzida pela luz, num espaço-temporal activação controlada de GTPases pequenas pela combinação de duas técnicas: (1) rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e (2) um método de foto-enjaulamento de rapamicina. Com o uso de rapamicina mediada heterodimerização FKBP FRB-, desenvolvemos um método para rapidamente induzível activação ou inactivação de pequeno GTPases including Rac 4, Cdc42 4, RhoA 4 e 5 Ras, em que a rapamicina induz a translocação de FKBP-fundidos GTPases, ou os seus activadores, para a membrana plasmática, onde está ancorada FRB. Para o acoplamento com o presente sistema de heterodimerização, também desenvolvido um sistema foto-enjaulamento de análogos de rapamicina. Um composto de foto-engaiolados é uma molécula pequena, cuja actividade é suprimida com um grupo fotocliváveis ​​proteger conhecido como um grupo de encarceramento. Para suprimir a actividade heterodimerização completamente, foi elaborado um rapamicina engaiolados que está preso a uma macromolécula tal que o complexo resultante grande não pode atravessar a membrana plasmática, levando a virtualmente nenhum fundo actividade como um dimerizer química no interior das células 6. A Figura 1 ilustra um esquema do nosso sistema. Com a combinação destes dois sistemas, é localmente recrutado um activador Rac para a membrana plasmática num espaço de tempo de segundos, e conseguido induzida pela luz de activação Rac no lev subcelularel 6.

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Um método para espácio-temporal controlo da actividade GTPase pequena pela luz é descrito. Este método baseia-se em rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e foto-enjaulamento sistemas. Otimização de luz irradiação permite a ativação espaço-temporalmente controlada de pequenas GTPases no nível subcelular.

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Beads separação e Células em dispositivos multi-canal microfluídicos Usando dieletroforese e Fluxo Laminar

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Bioengenharia

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Imagem Lifetime fluorescência de rotores moleculares em células vivas

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolamento de células do cólon tumor primário Humanos a partir de tecidos cirúrgicos e cultivando-as Diretamente macias elásticas Substratos para Traction Citometria

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Microscopia de fluorescência de luz-folha para capturar imagens 4-Dimensional dos efeitos de modulação de tensão de cisalhamento sobre o coração em desenvolvimento de Zebrafish

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...