Name: spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Это исследование было поддержано НИЗ финансирования научных исследований (DK090868 и GM092930 ТИ). Существует в ожидании патента на клетке рапамицин аналог.

1. Трансфекция ДНК плазмиды <ol><li> Добавить плазмидных ДНК, 0,5 мкг мембранного привязанные ФРБ (далее LDR) и 0,5 мкг FKBP-Tiam1 (Т-клеточной лимфомы вторжения и метастаза вызывающие белок 1: Rac активатор) помечены флуоресцентным белком до 37,5 мкл дН 2 O. Добавить 1 мкл FuGENE HD. </li><li> Vortex и инкубирова...

<ol>
	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light.">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li><li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

Мы описали технику, которая использует новые соединения в клетках вместе с FKBP-FRB гетеродимеризации системы для того, чтобы манипулировать Rho ГТФ деятельность в точном внутриклеточной локализации на временной шкале в секундах. Существуют три ограничения данного подхода...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента / оборудование </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Рапамицина </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Авидин </td><td> Сигма </td><td> A9275-10мг </td></tr><tr><td> ДМСО </td><td> Сигма </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Гель-колонки </td><td> GE Healthcare </td><td> Спин Trap G-25 </td></tr><tr><td> С прозрачным дном 8-и камера </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Перевернутый флуоресцентный микроскоп </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> УФ-светодиодный источник света </td><td> Рапп Opto Electronics </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Конфокальной вращающийся диск </td><td> Корпорация Yokogawa Electric </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD камеры </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> Объектив 100x </td><td> Zeiss </td><td> План Apochromat </td></tr></tbody></table> Синтетическая схема CRB (Copyright ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Схема 1" /></a> Синтетические условиям: (а) BnBr, K 2 CO 3, DMF (б) f.HNO 3 АсОН (с) ТФК (г) пропаргил-Br, K 2 CO 3, DMF, (д), глицерин, кот. PTSA, толуол (е) NaBH 3 CN, TiCl 4, MeCN (г) Т 2 O, пиридин (H) метанол HCl, (я) LiAlH 4, ТГФ (к) TsCl, пиридин, CH 2 Cl 2 (к) NaN 3, DMF (л) 8, 2,6-ди-трет-butylpyridine, CH 2 Cl 2 (м) 13, CuSO 4, аскорбиновая кислота, 2-пропанол, H 2 O, CH 2 Cl 2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

Динамическое регулирование семьи Ро малого triphosphatases гуанозин (GTPases) с большой пространственно-временной точностью имеет важное значение для различных клеточных функций и мероприятий 1, 2. Их spatiotemporally динамичный характер был выявлен по визуализации их деятельности и локализации в реальном времени 3. Для того чтобы получить более глубокое понимание их роли в различных клеточных функций на молекулярном уровне, то следующим шагом должно быть возмущение белка деятельность в точном внутриклеточной локализации и времени. Для достижения этой цели мы разработали метод светоиндуцированного, пространственно-временное контролируемое активации малых ГТФаз путем объединения двух методов: (1) рапамицин вызванных FKBP-FRB гетеродимеризации и (2) фото-останов метод рапамицина. С помощью рапамицина опосредованного FKBP-FRB гетеродимеризации, мы разработали метод быстрого индуцибельной активации или инактивации малых ГТФаз includiнг Rac 4, Cdc42 4 RhoA 4 и Рас-5, в котором рапамицин вызывает перемещение FKBP слившихся GTPases или их активаторов, к мембране, где ФРС на якорь. В связи с этим гетеродимеризации системы, мы также разработали фото-останов системы рапамицина аналогов. Фото-клетках соединение маленькие молекулы, чья деятельность подавляется с photocleavable защиты группы, известной как удерживание группы. Для подавления гетеродимеризации деятельность полностью, мы разработали в клетке рапамицина, которые привязаны к макромолекуле такие, что в результате большого комплекса не может пересечь плазматической мембраны, что приводит к практически без фоновой активности в качестве химического dimerizer внутри клеток 6. На рисунке 1 показана схема нашей системы. Благодаря сочетанию этих двух систем, мы набранных на местах Rac активатора плазматической мембраны на шкале времени в секундах и достигли светоиндуцированного Rac активации на субклеточном левэль-6.

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Метод пространственно-временной контроль деятельности малого ГТФ света описывается. Этот метод основан на рапамицин вызванных FKBP-FRB гетеродимеризации и фото-останов системы. Оптимизация светового облучения позволяет пространственно-временном управлять активацией малых ГТФаз на субклеточном уровне.

Пространственно-временные манипуляции малых активность ГТФ на субклеточном уровне, и на шкале времени секунды в живых клетках

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Разделение Бусы и клетки в Многоканальные Устройства микрожидкостных Использование Диэлектрофорез и ламинарного потока

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Флуоресценции жизни молекулярных роторов в живых клетках

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Количественный и временной контроль кислорода микроокружения в Единой Иле уровня

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Выделение первичных клеток человека Колон опухоль из хирургических тканей и культивирование их прямо на мягкий эластичный субстратов для тяговых цитометрии

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Метку без Методика пространственно-временных изображений из одной клетки секрета

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Оптический контроль живых клеток электрической активности по сопряженных полимеров

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Совместное культивирование жизни микробиомом с Microengineered человека ворсинок кишечника в Gut-на-чипе микрожидкостных устройств

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Изоляция мезенхимальных стволовых клеток человека надкостницей альвеолярного и эффекты витамина d на Остеогенные активность клеток, надкостницы, полученных

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Измерение силы чувствительных белка динамики в живых клетках, используя комбинацию люминесцентные методы

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...