Name: spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Denna studie stöddes av NIH forskningsmedel (DK090868 och GM092930 till TI). Det finns en väntande patent på en bur rapamycin analog.

1. Transfektion av plasmid-DNA <ol><li> Tillsätt plasmid-DNA och 0,5 pg membran-bunden FRB (hädanefter kallad LDR) och 0,5 ^ g av FKBP-Tiam1 (T-cell-lymfom och metastas-inducerande protein 1: Rac aktivator) märkt med fluorescerande protein till 37,5 | il dHaO 2 O. Tillsätt 1 pl Fugene HD. </li><li> Vortexa och inkubera vid rumstemperatur under 20 minuter. Under tiden, gå till steg 1,3-1,8. </li><li> Tvätta varje brunn av en 8-brunns kammare med 50 | il poly-D-lysin. </li><li> Tvätta mitten av varje b...

<ol>
	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light.">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li><li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

Vi beskrivit en teknik som använder en ny bur förening tillsammans med FKBP-FRB heterodimerisering system för att manipulera Rho GTPase verksamhet på ett exakt subcellulär plats på en tidsskala av sekunder. Det finns tre begränsningar av det nuvarande tillvägagångssättet. För det första eftersom metoden bygger på att förebygga eller tillåter diffusion av Dimeriserings över plasmamembranet behöver målet cellulära platsen att vara plasmamembranet eller dess närhet. Ytterlig...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / utrustning </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Rapamycin </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidin </td><td> Sigma </td><td> A9275-10mg </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Storleks-exklusionskolonn </td><td> GE Healthcare </td><td> Spin trap G-25- </td></tr><tr><td> Glasbotten 8-och kammare </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Inverterat fluorescensmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV-LED-ljuskälla </td><td> Rapp Opto Electronics </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Konfokal roterande skiva </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD-kamera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> 100x Mål objektiv </td><td> Zeiss </td><td> Planen Apochromat </td></tr></tbody></table> Syntetisk system för CRB (Copyright ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Schema 1" /></a> Syntetiska betingelser: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) TFA (d) propargyl-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) glycerol, kat. PTSA, Toluen (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf 2 O, pyridin (h) metanol-HCl, (i) 4 LiAlH, THF (j) TsCl, Pyridin, CH2CI 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridin, CH2CI 2 (m) 13, CUSO4, askorbat-, 2-propanol, H2O, CH2CI 2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

Dynamisk reglering av Rho familj av små guanosin triphosphatases (GTPases) med stor Spatiotemporal precision är viktigt för olika cellfunktioner och evenemang 1, 2. Deras spatiotemporally dynamiska karaktär har avslöjats av visualisering av deras verksamhet och lokalisering i realtid 3. För att få djupare förståelse för deras roller i olika cellulära funktioner på molekylär nivå, bör nästa steg vara störning av protein aktiviteter på ett exakt subcellulär plats och tidpunkt. För att uppnå detta mål har vi utvecklat en metod för ljus-inducerad, rums-tidsmässigt styrd aktivering av små GTPases genom att kombinera två metoder: (1) rapamycin-inducerad FKBP-FRB heterodimerisering och (2) en foto-placering i bur metod rapamycin. Med hjälp av rapamycin-medierad FKBP-FRB heterodimerisering, har vi utvecklat en metod för att snabbt induceras aktivering eller inaktivering av små GTPases including Rac 4, 4 Cdc42, RhoA 4 och Ras 5, i vilken rapamycin inducerar translokation av FKBP-fuserade GTPaser, eller deras aktivatorer, till plasmamembranet där FRB är förankrad. För koppling med detta heterodimerisering system har vi också utvecklat en foto-placering i bur system rapamycin analoger. Ett foto-bur föreningen är en liten molekyl vars aktivitet hämmas med en fotoklyvbar grupp känd som en bur grupp. För att undertrycka heterodimerisering verksamheten helt, utformade vi en bur rapamycin som är bundna till en makromolekyl så att det resulterande stora komplexet inte kan passera plasmamembranet, vilket leder till praktiskt taget ingen bakgrund aktivitet som en kemisk Dimeriserings inuti celler 6. Figur 1 visar ett schema av vår systemet. Med kombinationen av dessa båda system, rekryterade vi lokalt ett Rac aktivator till plasmamembranet på en tidsskala av sekunder och nådde ljus-inducerad Rac aktivering på subcellulära Level 6.

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

En metod för spatio-temporal kontroll av små GTPas-aktivitet genom ljus beskrivs. Denna metod är baserad på rapamycin-inducerad FKBP-FRB heterodimerisering och foto-placering i kasse system. Optimering av ljus-bestrålning gör det möjligt för rums-tidsmässigt styrd aktivering av små GTPases på subcellulära nivå.

Tid och rum Manipulering av små GTPas aktivitet på Subcellulär nivå och Tidsplan sekunder i levande celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Separera Pärlor och celler i flera kanaler mikroflödessystem enheter Använda Dielectrophoresis och laminär strömning

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Fluorescens Lifetime Imaging of Molecular Rotorer i levande celler

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Kvantitativ och Temporal Kontroll av syremikromiljö vid den inre Islet nivå

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolering av primära humana kolontumörceller från kirurgiska vävnader och Odling dem direkt på mjuka elastiska substrat för Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

En etikett-fri teknik för spatiotemporala avbildning av en enda cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk kontroll av levande celler elektrisk aktivitet av konjugerade polymerer

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur av levnads- Microbiome med Microengineered Human Intestinal Villi i en Gut-on-a-chip mikroflödessystem enhet

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering av mesenkymala stamceller från mänskliga alveolära periostet och effekter av D-Vitamin på osteogent aktivitet av periostet-derived celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Ljus-ark fluorescensmikroskopi att fånga 4-dimensionella bilder av effekterna av modulerande skjuvspänningen på utveckla zebrafiskar hjärtat

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Mätning av kraft-känsliga Protein Dynamics i levande celler med hjälp av en kombination av fluorescerande tekniker

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...