Name: spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Bu çalışma NIH araştırma fonu (DK090868 ve TI GM092930) tarafından desteklenmiştir. Kafesli bir rapamisin analog bir patent var.

1. Plazmid DNA transfeksiyon <ol><li> 37.5 ul dH 2 O kadar floresan proteini tagged: plazmid DNA&#39;lar, 0.5 mikrogram membran-gergin FRB (bundan sonra LDR olarak anılacaktır) ve 0.5 mg FKBP-Tiam1 (Rac aktivatör T-hücreli lenfoma invazyon ve metastaz uyaran protein 1) ekle 1 ul FuGENE HD ekleyin. </li><li> 20 dakika için oda sıcaklığında vorteks ile inkübe. Bu arada, adım 1,3-1,8 geçin. </li><li> 50 ul poli-D-Lizin içeren bir 8-de haznesinin her oyuğa yıkanır. </li><li> DH 2 O he...

<ol>
	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light.">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li><li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

Biz saniyelik bir zaman ölçeği üzerinde doğru bir hücre içi yerde Rho GTPaz aktivitesi işlemek üzere FKBP-FRB heterodimerization sistemine sahip bir yeni bileşik kafeste birlikte çalıştığı bir yöntem tarif. Bu yaklaşımın üç sınırlamalar vardır. Metodu plazma membranında dimerizer difüzyonu önlenmesi veya izin bağlı olduğu Birincisi, hedef hücresel plazma membranında konuma yada çevresi olması gerekmektedir. KİB kimyasal yapısı daha ileri optimizasyon bil...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Rapamisin </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidin </td><td> Sigma </td><td> A9275-10mg </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Boyut-dışlama sütun </td><td> GE Healthcare </td><td> Spin Tuzak G-25 </td></tr><tr><td> Cam alt 8-iyi kamara </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Ters Floresan mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV ışık kaynağı LED </td><td> Rapp Opto Elektronik </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Konfokal dönen disk </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> 100x Objektif lens </td><td> Zeiss </td><td> Planı Apochromat </td></tr></tbody></table> KİB Sentetik şeması (Copyright ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Şema 1" /></a> Sentetik koşullar: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) 3 f.HNO, AcOH (c), TFA (d) propargil-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) gliserol, kedi. PTSA, Toluen (f) NaBH3CN, TiCl 4, MeCN (g) Tf 2 O, Piridin (h) metanol HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, Piridin, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH 2 Cl 2 (m) 13, CuSO 4, askorbat, 2-propanol, 2 H, O, CH2 Cl2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

Büyük zamanmekansal hassasiyetle küçük guanozin triphosphatases (GTPases) ve Rho ailesinin Dinamik yönetmelik çeşitli hücresel fonksiyonları ve olaylar 1, 2 için gereklidir. Onların spatiotemporally dinamik yapısı gerçek zamanlı 3 de, faaliyet ve yerelleşme görselleştirme tarafından ortaya konmuştur. Moleküler düzeyde çeşitli hücresel fonksiyonların rolleri daha derin bir anlayış kazanmak için, bir sonraki adım, kesin Subselüler konum ve zamanlama ile protein faaliyetlerinin pertürbasyon olmalıdır. (1) rapamisin bağlı FKBP-FRB heterodimerization ve rapamisin (2) Fotoğraf-kafes yöntemi: Bu hedefe ulaşmak için, ışık kaynaklı, iki tekniği birleştirerek küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon için bir yöntem geliştirdik. Rapamisin aracılı FKBP-FRB heterodimerization kullanımı ile, hızla küçük GTPases includi aktivasyonu veya inaktivasyonu indüklenebilir için bir yöntem geliştirding Rac 4, rapamisin FRB tutturulduğu plazma zarına, FKBP-erimiş GTPases, ya da bunların aktivatörlerinin translokasyonu indüklemektedir hangi Cdc42 4, RhoA 4 ve 5 Ras,. Bu heterodimerization sistemi ile bağlantı için, biz de rapamisin analoglarının bir foto-kafes sistemi geliştirdik. A foto-kafeste bileşiğin aktivitesi olan bir kafes grubu olarak bilinen bir photocleavable koruyucu grup ile bastırılmış, küçük bir moleküldür. Tamamen heterodimerization faaliyetleri bastırmak için, hücrelerin 6 içinde kimyasal bir dimerizer olarak neredeyse hiçbir plan aktivitesi yol, elde edilen büyük ve karmaşık bir plazma zarı geçemez öyle bir makromolekül tethered bir kafese rapamisin tasarlanmıştır. Şekil 1 bizim bir düzeni göstermektedir sistem. Bu iki sistemin kombinasyonu ile, yerel saniyelik bir zaman ölçeği üzerinde plazma membranı bir Rac aktivatörü işe ve Subselüler lev ışık kaynaklı Rac aktivasyon eldeEl 6.

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Işık tarafından küçük GTPaz aktivitesinin yerleşim-zaman kontrolü için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, rapamisin indüklenen FKBP-FRB heterodimerization ve foto-kafes sistemleri dayanmaktadır. Işık ışınlama Optimizasyonu Subselüler düzeyindeki küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon sağlar.

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Çok kanallı mikroakışkan Cihazlar ayırmak Boncuk ve Hücreler Dielectrophoresis ve Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Biyomühendislik

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Tek Adacık Düzeyde Oksijen mikroçevresinin Nicel ve Geçici Kontrol

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cerrahi Dokular İlköğretim İnsan Kolon Tümör Hücreleri İzolasyon ve Çekiş Sitometrinin Yumuşak Elastik Yüzeyler Doğrudan onları Kültürleme

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Yalıtım insan alveoler kapaklarini ve Osteojenik etkinlik kapaklarini türetilmiş hücre D vitamini etkileri Mezenkimal kök hücrelerin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...