Name: single-cell analysis of bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry
Uploaded: 2012-02-15T12:00:00
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この作品は、ヴュルツブルク大学の感染症研究センター（ZINF）から、若手研究プログラムによって運営されている。フアン·C·ガルシア·Betancurは、ヴュルツブルク大学の生命科学研究科（脂質）から博士課程の仲間です。

1。ラベリングB.枯草菌とバイオフィルム形成アッセイ<ol><li> PCRにより目的の遺伝子のプロモーター領域を増幅する。ここでは、例としてP タパ 、TASAマトリックスタンパク質26の産生に関与する遺伝子のプロモーターのクローニングを示しています。 pkm008ベクターへのクローンP タパ （Rudnerラボ、ハーバード·メディカル·スクール、ボストン、?...

<ol>
	<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microbial+biofilms.">Overview of microbial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).</li><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms:+from+ecology+to+molecular+genetics.">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).</li><li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+microbial+communities:+biofilms,+interactions,+and+genetic+systems.">Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems.</a> Annu. Rev. 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B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+heterogeneity+during+growth+of+Bacillus+subtilis.">Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+signaling+in+a+bacterium.">Paracrine signaling in a bacterium.</a> Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+differential+gene+expression+by+improved+cyan+fluorescent+protein+and+yellow+fluorescent+protein+production+in+Bacillus+subtilis.">Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+gene+expression+patterns+of+competence+development+and+initiation+of+sporulation+in+Bacillus+subtilis+grown+on+chemically+defined+media.">Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media.</a> J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).</li><li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture,+sporulation,+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis.">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KinD+is+a+checkpoint+protein+linking+spore+formation+to+extracellular-matrix+production+in+Bacillus+subtilis+biofilms.">KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms.</a> MBio. 1, (2010).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis.">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+enhances+biofilm+development+in+Bacillus+subtilis.">Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li><li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactin,+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis:+isolation,+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation.">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li><li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms.">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Novick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+systems+in+staphylococci.">Genetic systems in staphylococci.</a> Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).</li><li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1.">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Nakano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=srfA+is+an+operon+required+for+surfactin+production,+competence+development,+and+efficient+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).</li><li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+by+sporulating+bacteria.">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism.">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li><li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms.">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li></ol>

細菌群集は、特定の遺伝子の証拠一連の微生物群集33,34の複雑性を発現する細胞の集団を示しているという事実。このプロトコルは、関心のある任意の遺伝子の発現が微生物群集内に特殊化した細胞の特定の集団に限定されているかどうかを判断するのに役立ちます。伝統的な方法は、全体の微生物群集と微生物群集内で遺伝子発現の変動に遺伝子発現やマイク​​ロアレイ解析率遺...

<table border="1"><tbody><tr><td> テクニック </td><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg構成</td><td> 5mMのリン酸カリウム</td><td>ロート</td><td> 6878 </td></tr><tr><td> 100mMのMOPS </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M1254 </td></tr><tr><td>塩化マグネシウム2mMの</td><td>ロート</td><td> 2189.1 </td></tr><tr><td>塩化カルシウム700μM </td><td>ロート</td><td> A119.1 </td></tr><tr><td>塩化第二鉄50μM </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 157740 </td></tr><tr><td>塩化亜鉛1​​μM </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td>チアミン2μM </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 74625 </td></tr><tr><td>グリセロール0.5パーセント</td><td>ロート</td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Glutaメイト0.5パーセント</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 49621 </td></tr><tr><td>トリプトファン50μg/mlの</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T0254 </td></tr><tr><td>フェニルアラニン50μg/mlの</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P2126 </td></tr><tr><td>細胞固定</td><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ロート</td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>超音波処理</td><td>セルソニケーター</td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡検査法</td><td>蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> ソフトウェアの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡検査法</td> &lt;TD&gt;アサフ</td><td>ライカ</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー</td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー</td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell analysis of bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry

バイオフィルム形成は、ほぼすべての細菌1-6一般的な属性です。細菌がバイオフィルムを形成するとき、細胞は主に7月10日 、他の要因の中で、タンパク質やexopolysaccharidesによって構成されている細胞外マトリックスに収められています。微生物群集は、多くの場合、11月17日特殊化した細胞の異なる集団の分化を示しています。バイオフィルム内に納められた。これらの集団が共存し、しばしばフィルム18から21の中で空間的および時間的な組織を示しています。 モデル生物の枯草菌のバイオフィルム形成は、特殊な細胞の異なる集団の分化をする必要があります。その中で、バイオフィルムの細胞外マトリックスを生成し、分泌する責任マトリックスプロデューサーの集団は、バイオフィルム形成11,19のために不可欠である。したがって、マトリックスの生産の分化は、Bのバイオフィルム形成の特徴である枯草菌。 我々は、Bのバイオフィルムのマトリックスの生産者の集団を視覚化し、定量化するために蛍光レポーターを使用している枯草菌 15,19,22-24。具体的には、マトリックスの生産者集団は、セルフ·プロデュース細胞外シグナルサーファ25の存在に応答して区別することを観察した。興味深いことに、サーファクチンは、マトリックスの生産者15の集団とは異なる特殊な細胞の集団によって生成されます。 我々は、このレポートで枯草菌のバイオフィルム内のマトリックスの生産者とサーファクチン生産者の集団を可視化し、定量化するために必要な技術的アプローチを紹介しています。これを行うには、行列の生産とサーファクチン生産に必要な遺伝子の蛍光レポーターは、Bの染色体に挿入され枯草菌 。記者は、特殊化した細胞の集団で表現されます。その後、集団は、することができます（図1参照）蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて監視されます。 特殊化した細胞の異なった集団は、細菌の多地域内で共存するという事実は私達に原核生物における遺伝子発現の調節に関する異なる視点を提供します。このプロトコルは、実験的にこの現象に対処し、それが容易に微生物のコミュニティ内で表現型の不均一性の根底にある分子機構を解明するために、他の作業モデルに適合させることができます。

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Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

微生物のバイオフィルムは、一般的に特殊化した細胞の異なる集団によって構成されています。これらの集団の単一細胞解析では、蛍光レポーターを使用する必要があります。ここでは、いくつかのsubpopulationswithinを視覚化し、監視するためのプロトコルについて説明します。<em&gt; B.枯草菌</em&gt;蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いたバイオフィルム。

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

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の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

熱の予防によりラットに悪影響をストレス<em&gt;枯草菌</em&gt;ひずみ

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

研究のための方法論<em&gt; B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての&gt;バイオフィルム

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム