Name: single-cell analysis of bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry
Uploaded: 2012-02-15T12:00:00
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Este trabalho é financiado pelo Programa Jovem Investigador de Pesquisa, do Centro de Pesquisas de Doenças Infecciosas (Zinf) da Universidade de Würzburg. Juan C Garcia-Betancur é uma bolsa de doutoramento da Escola de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (GSLs) da Universidade de Würzburg.

1. Rotulagem B. subtilis e ensaio de formação de biofilme <ol><li> Amplificar por PCR da região promotora do gene de interesse. Nós mostramos como exemplo, a clonagem de P tapa, o promotor dos genes responsáveis ​​pela produção de proteína de matriz Tasa 26. Clone P tapa em pkm008 vetor (criado pelo laboratório Rudner, Harvard Medical School. Boston, EUA) (Fig. 2). </li><li> Linearizar os plasmídeos por digestão enzimática (Enzyme recomendada,...

<ol>
	<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microbial+biofilms.">Overview of microbial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).</li><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms:+from+ecology+to+molecular+genetics.">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).</li><li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+microbial+communities:+biofilms,+interactions,+and+genetic+systems.">Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms.">Biofilms.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).</li><li>Branda, S. 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B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+heterogeneity+during+growth+of+Bacillus+subtilis.">Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+signaling+in+a+bacterium.">Paracrine signaling in a bacterium.</a> Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+differential+gene+expression+by+improved+cyan+fluorescent+protein+and+yellow+fluorescent+protein+production+in+Bacillus+subtilis.">Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+gene+expression+patterns+of+competence+development+and+initiation+of+sporulation+in+Bacillus+subtilis+grown+on+chemically+defined+media.">Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media.</a> J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).</li><li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture,+sporulation,+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis.">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KinD+is+a+checkpoint+protein+linking+spore+formation+to+extracellular-matrix+production+in+Bacillus+subtilis+biofilms.">KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms.</a> MBio. 1, (2010).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis.">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+enhances+biofilm+development+in+Bacillus+subtilis.">Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li><li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactin,+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis:+isolation,+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation.">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li><li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms.">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Novick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+systems+in+staphylococci.">Genetic systems in staphylococci.</a> Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).</li><li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1.">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Nakano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=srfA+is+an+operon+required+for+surfactin+production,+competence+development,+and+efficient+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).</li><li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+by+sporulating+bacteria.">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism.">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li><li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms.">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li></ol>

O fato de que as comunidades bacterianas mostrar subpopulações de células que expressam conjunto específico de genes evidencia a complexidade das comunidades microbianas 33,34. Este protocolo deve ajudar a determinar se a expressão de qualquer gene de interesse é restrita a uma subpopulação específica de células especializadas na comunidade microbiana. Visualização destas subpopulações exige o desenvolvimento de novas técnicas, porque os métodos tradicionais para monitorizar a expressão do ge...

<table border="1"><tbody><tr><td> Técnica </td><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg composição </td><td> fosfato de potássio 5 mM </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> MOPS 100mM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio 2mM </td><td> Roth </td><td> 2189,1 </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio 700μM </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> Férricos 50 ìm de cloreto </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> 1μM cloreto de zinco </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> Tiamina 2μM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> Glicerol 0,5% </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Gluta% companheiro de 0,5 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> Triptofano 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> Fenilalanina 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> Fixação das células </td><td> Paraformaldeído </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Sonicação </td><td> Sonicador celular </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> A microscopia de fluorescência </td><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Nome do software </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> A microscopia de fluorescência </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> A citometria de fluxo </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> A citometria de fluxo </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell analysis of bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry

Formação de biofilme é um atributo geral para quase todos 1-6 bactérias. Quando as bactérias formar biofilmes, as células são encerradas em matriz extracelular que é principalmente constituída por proteínas e exopolissacarídeos, entre outros factores 7-10. A comunidade microbiana encaixada dentro do biofilme, muitas vezes mostra a diferenciação de subpopulação distinta de células especializadas 11-17. Estas subpopulações coexistir e muitas vezes mostram organização espacial e temporal dentro do biofilme 18-21. A formação de biofilme no modelo de Bacillus subtilis organismo requer a diferenciação de subpopulações distintas de células especializadas. Entre eles, a subpopulação de produtores de matriz, responsáveis ​​para produzir e secretar a matriz extracelular do biofilme é essencial para a formação de biofilme 11,19. Assim, a diferenciação dos produtores de matrizes é uma característica da formação de biofilme em B. subtilis. Usámos repórteres fluorescentes para visualizar e quantificar a subpopulação de produtores de matriz em biofilmes de B. subtilis 15,19,22-24. Concretamente, observou-se que a subpopulação de produtores de matriz diferencia em resposta à presença de auto-produzido sinal extracelular surfactina 25. Curiosamente, surfactina é produzida por uma subpopulação de células especializadas diferentes a partir da subpopulação de produtores de matriz 15. Temos detalhadas neste relatório a abordagem técnica necessária para visualizar e quantificar a subpopulação de produtores de matrizes e produtores surfactina dentro dos biofilmes de B. subtilis. Para fazer isso, repórteres fluorescentes de genes necessários para a produção de matriz e da produção surfactina são inseridos no cromossoma de B. subtilis. Repórteres são expressos apenas em uma subpopulação de células especializadas. Em seguida, as subpopulações pode sermonitorizada utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo (ver Fig. 1). O fato de que diferentes subpopulações de células especializadas coexistir dentro de comunidades multicelulares de bactérias nos dá uma perspectiva diferente sobre a regulação da expressão gênica em procariontes. Este protocolo aborda esse fenômeno experimentalmente e pode ser facilmente adaptado a qualquer modelo de outros, para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à heterogeneidade fenotípica dentro de uma comunidade microbiana.

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Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilmes microbianos são geralmente constituídos por subpopulações distintas de células especializadas. De célula única análise destas subpopulações requer a utilização de repórteres fluorescentes. Aqui nós descrevemos um protocolo para visualizar e monitorar vários subpopulationswithin<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilmes através de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.

Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

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Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

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Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

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The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

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This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

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