Name: real-time monitoring of ligand-receptor interactions with fluorescence resonance energy transfer
Uploaded: 2012-08-20T12:00:00
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Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido através da National Science Foundation, Instituto Nacional de Saúde (NIH), Tecnologia de Materiais Center (MTC) e ORDA em SIUC. Agradecemos a NSF para uma subvenção (CHE-0959568) para a compra de um FE-SEM. Gostaríamos de agradecer ao Prof Mateus McCarroll para discussões úteis. Julia Reyes vai agradecer a COLCIENCIAS, Agência colombiano e Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colômbia por sua bolsa de estudos e apoio financeiro.

A. Síntese e Caracterização de Lipossomas de PDA 4,5,6 Nota 1: Proteger a solução da luz PDA usando embalagem de alumínio em cada recipiente ao longo de todas as etapas experimentais. Nota 2: Dois conjuntos diferentes de solução de lipossoma (B e C) foram preparadas seguinte procedimento A (Síntese e caracterização de lipossomas de PDA). 1. Síntese de N-hidroxi-succinimida Diacteylene (NHS-PCDA) <ol><li> Para pre...

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).</li><li>Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Colorimetric+Detection+of+a+Receptor-Ligand+Interaction+by+a+Polymerized+Bilayer+Assembly.">Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly.</a> Science. 261, 585-588 (1993).</li><li>Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Conceptual+and+Technological+Advances+in+Polydiacetylene-based+Supramolecular+Chemosensors.">Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).</li><li>Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Molecular+Interactions+in+Biosensors+Based+on+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer.">Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer.</a> J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).</li><li>Li, X., Matthews, S., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Polydiacetylene+Liposomes.">Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).</li><li>Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Conjugated+Liposomes.">Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes.</a> Langmuir. 22, (2006).</li><li>New, R. R. C., New, R. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).</li><li>Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+and+Fluorometric+Detection+of+Cationic+Surfactants+Based+on+Conjugated+Polydiacetylene+Supramolecules.">Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules.</a> Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).</li><li>Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Color+Display+System+Based+on+Thermochromic+Conjugated+Polydiacetylene.">A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene.</a> Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).</li></ol>

Realizamos a ligação selectiva do resíduo de lisina da proteína na superfície dos lipossomas utilizando NHS-amina reacção. Este método baseado em FRET é capaz de fazer o acompanhamento em tempo real de ligação biotina-estreptavidina e proteína (BSA), a ligação à superfície do lipossoma. Procedimento semelhante pode ser aplicado para estudar a dinâmica das interacções de ligação proteína diferentes com os seus receptores selectivos. Há flexibilidade na escolha de fluoróforos que irá proporcionar ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 10,12-pentacosadiynoic ácido (PCDA) </td><td> GFS produtos químicos </td><td> 3261 </td><td> Sensível à luz </td></tr><tr><td> N-hidroxi-succinimida (NHS) </td><td> Acros Organics </td><td> 157270250 </td><td> Sensíveis à umidade </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (EDC) </td><td> Chem-impex Internacional </td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina-tagged Ser Bovinehum Albumina (BSA-Rh) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (biotina-DOPE) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time monitoring of ligand-receptor interactions with fluorescence resonance energy transfer

FRET é um processo pelo qual a energia é não-radiativamente transferido de uma molécula dadora para uma molécula animado aceitador estado fundamental por meio de longo alcance interacções dipolo-dipolo 1. No presente ensaio de detecção, utiliza-se uma propriedade interessante de PDA: deslocamento de azul no espectro de absorção de UV-Vis de PDA electrónica (Figura 1) depois de um analito interage com os receptores ligados a PDA 2,3,4,7. Esta mudança no espectro de absorção no PDA proporciona mudanças nas sobreposição espectral (J) entre os PDA (aceitador) e rodamina (dador) que levam a alterações na eficiência de TERF. Assim, as interacções entre a substância a analisar (ligante) e os receptores são detectados através de FRET entre fluoróforos doadores e PDA. Em particular, mostramos a detecção de uma molécula de estreptavidina modelo de proteína. Nós também demonstram a ligação covalente-albumina de soro bovino (BSA) a superfície do lipossoma com FRET mecanismo. Essas interações entre tele lipossomas de bicamada e moléculas de proteína pode ser detectado em tempo real. O método proposto é um método geral para detecção química pequenas e grandes moléculas bioquímicas. Uma vez que a fluorescência é intrinsecamente mais sensível do que a colorimetria, o limite de detecção do ensaio pode ser na gama sub-nanomolar ou inferior 8. Além disso, o PDA pode actuar como um aceitador FRET universal, o que significa que vários sensores podem ser desenvolvidos com PDA (aceitador) funcionalizado com doadores e receptores diferentes ligados à superfície dos lipossomas de PDA.

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Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Demonstramos FRET entre polydiacetylene polímero conjugado (PDA) e fluoróforo ligado à superfície dos lipossomas de PDA para a detecção de biomoléculas. PDA lipossomas também continha moléculas receptoras nas suas superfícies de biomoléculas a ser utilizados como sondas. Interacções ligando-receptor conduzir a alterações na eficiência de TERF entre o fluoróforo e o PDA, que é a base de mecanismo de detecção.

Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Research

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Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

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Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

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Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

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Imagens em campo amplo e em tempo real de sinais de feridas locais e sistêmicas em Arabidopsis

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