Name: a genetic screen to isolate toxoplasma gondii host-cell egress mutants
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants at JoVE.com

Ce travail a été financé par l&#39;American Heart Association scientifique de développement 0635480N Grant et National Institutes of Health des subventions de recherche AI081220. BIC est soutenu par une Templiers Eye Foundation subvention de recherche.

Vue d&#39;ensemble Les protocoles sont fournis à d&#39;abord définir le dosage de l&#39;agent mutagène menant à un meurtre de 70% des parasites (protocole 1). La procédure suivante est prévue pour enrichir les mutants induits évacuation d&#39;un bassin mutagénisé parasite (protocole n ° 2, figure 2). Cette opération est suivie par un protocole pour tester l&#39;incidence de mutants d&#39;évacuation dans la piscine enrichi, ou pour valider le phénotype de sortie dans des mutants ind...

<ol>
	<li>Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+and+acetaldehyde+elevate+intracellular+[Ca2+]+and+stimulate+microneme+discharge+in+Toxoplasma+gondii.">Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii.</a> Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).</li><li>Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loss+of+cytoplasmic+potassium+upon+host+cell+breakdown+triggers+egress+of+Toxoplasma+gondii.">The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).</li><li>Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+activation+of+the+Toxoplasma+gondii+nucleoside+triphosphate+hydrolase+leads+to+depletion+of+host+cell+ATP+levels+and+rapid+exit+of+intracellular+parasites+from+infected+cells.">Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells.</a> J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).</li><li>Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+dithiol-induced+Ca2++flux+causes+egress+of+parasites+from+the+parasitophorous+vacuole.">Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole.</a> Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).</li><li>Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+induction+of+egress+by+the+potassium+ionophore+nigericin.">Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin.</a> Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).</li><li>Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+calcium+ionophore+A23187-mediated+exit+of+trophozoites+from+infected+murine+macrophages.">Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages.</a> Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).</li><li>Hoff, E. F., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Toxoplasma+egress+the+first+step+in+invasion.">Is Toxoplasma egress the first step in invasion.</a> Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).</li><li>Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+protein+secretion+potentiates+motility+in+Toxoplasma+gondii.">Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).</li><li>Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+protein+kinase+1+is+an+essential+regulator+of+exocytosis+in+Toxoplasma.">Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma.</a> Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).</li><li>Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophore-resistant+mutant+of+Toxoplasma+gondii+reveals+involvement+of+a+sodium/hydrogen+exchanger+in+calcium+regulation.">Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation.</a> J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).</li><li>Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophore-resistant+mutants+of+Toxoplasma+gondii+reveal+host+cell+permeabilization+as+an+early+event+in+egress.">Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).</li><li>Chandramohanadas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apicomplexan+Parasites+Co-Opt+Host+Calpains+to+Facilitate+Their+Escape+from+Infected+Cells.">Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells.</a> Science. , (2009).</li><li>Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screen+to+dissect+Toxoplasma+gondii+egress.">Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+isolation+and+preliminary+characterization+of+temperature-sensitive+mutants.">Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants.</a> Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+use+of+mutants+to+study+the+host-parasite+relationship.">Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship.</a> Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).</li><li>Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+complementation+in+apicomplexan+parasites.">Genetic complementation in apicomplexan parasites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).</li><li>White, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+rescue+of+a+Toxoplasma+gondii+conditional+cell+cycle+mutant.">Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant.</a> Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).</li><li>Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+Genetic+Analysis+of+the+Apicomplexan+Cell+Division+Cycle+in+Toxoplasma+gondii.">Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).</li><li>Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+uses+sulfated+proteoglycans+for+substrate+and+host+cell+attachment.">Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment.</a> Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).</li><li>Camps, M., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate.">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein.">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii.">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li><li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion.">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li><li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells.">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li><li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells.">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li><li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca(2+)+release+from+inositol+1,4,5-triphosphate+(IP(3))/ryanodine-sensitive+stores.">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li><li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii.">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li><li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection.">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li><li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li></ol>

<html> Le protocole décrit fournit une méthode efficace pour isoler des mutants de Toxoplasma avec un défaut de sortie. Nous avons réussi à isoler des mutants ainsi que différentes étapes de la voie de sortie, dont certains ont un phénotype invasion double 13. Les effets potentiels sur l&#39;invasion peut être déterminé en utilisant la soi-disant test rouge-vert, ce qui différencie envahi de non-envahis par des parasites coloration des anticorps différentiel 23,24. Pour les tes...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 Stock M dans le DMSO, conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 Stock M dans le DMSO, conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Sulfate de Dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 Stock mM dans du PBS </td></tr><tr><td> Diff Quick </td><td> EMD Chemicals </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-filtre </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 um filtre en polycarbonate </td><td> WhatmanSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hémocytomètre </td><td> Hausser scientifique </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 incubateurs </td><td> Divers fabricants </td><td></td><td> Humidifié, 5% de CO 2, à 35, 37 et 40 ° C </td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Divers fabricants </td><td></td><td> Idéalement inversé, à grand champ avec l&#39;objectif de l&#39;huile 63x ou 100x </td></tr></tbody></table> HBSSc (selon Black et al 11.): <ul><li> 98,0 ml Hanks Balanced Salt Solution (numéro de catalogue Hyclone SH30588) </li><li> 100 MgCl ul 1M 2 (100 mM fin) </li><li> 100 pi 1M CaCl 2 (100 mM fin) </li><li> 2,0 ml 1M Hepes pH 7,3 (20 mM fin) </li><li> 84 mg de NaHCO 3 (10 mM fin) </li></ul>

a genetic screen to isolate toxoplasma gondii host-cell egress mutants

Le répandue, intracellulaire obligatoire, parasite protozoaire Toxoplasma gondii qui cause la maladie opportuniste dans les patients immunodéprimés et provoque des malformations congénitales lors de l&#39;infection congénitale. Le cycle de réplication lytique est caractérisée par trois étapes: 1. invasion active d&#39;une cellule hôte nucléé; 2. réplication dans la cellule hôte; 3. évacuation connexion de la cellule hôte. Le mécanisme de sortie est de plus en plus apprécié comme un processus unique et très réglementé, qui est encore mal comprise au niveau moléculaire. Les voies de signalisation qui sous-tendent l&#39;évacuation ont été caractérisées par l&#39;utilisation d&#39;agents pharmacologiques agissant sur ​​les différents aspects des voies 1-5. En tant que tel, plusieurs déclencheurs indépendants d&#39;évacuation ont été identifiées qui convergent toutes sur la libération de Ca 2 + intracellulaire, un signal qui est également critique pour l&#39;invasion des cellules d&#39;accueil 6-8. Cette idée a informé une approche gène candidat qui a conduit à l&#39;identificationfication de la plante comme la protéine kinase dépendante du calcium (CDPK) impliqués dans l&#39;évacuation 9. En outre, quelques avancées récentes dans la compréhension de sortie ont été réalisés en utilisant (chimique) des approches génétiques 10-12. Pour combiner la richesse de l&#39;information pharmacologique de l&#39;accessibilité croissante génétique de Toxoplasma nous avons récemment créé un écran permettant l&#39;enrichissement de mutants du parasite avec un défaut de sortie cellule hôte 13. Bien que la mutagenèse chimique utilisant le N-éthyl-N-nitroso-urée (ENU) ou le méthanesulfonate d&#39;éthyle (EMS) a été utilisé pendant des décennies dans l&#39;étude de la biologie Toxoplasma 11,14,15, n&#39;est que récemment que la cartographie génétique des mutations qui sous-tendent les phénotypes devenu une routine 16 -18. En outre, en générant des mutants sensibles à la température, les processus essentiels peuvent être disséqués et les gènes sous-jacents directement identifié. Ces mutants se comporter comme de type sauvage en vertu de la température permissive (35 ° C), mais ne parviennent pas à proliferate à la température restrictive (40 ° C) en tant que résultat de la mutation en question. Ici, nous illustrer une nouvelle méthode de criblage phénotypique à isoler des mutants avec un phénotype sensible à la température de sortie 13. Le défi pour les écrans d&#39;évacuation est de séparer est sorti de non-évacué parasites, qui est compliqué par la ré-invasion rapide et collant générale des parasites aux cellules hôtes. Un écran de sortie a été précédemment établi sur la base d&#39;une série d&#39;étapes lourdes biotinylation de séparer intracellulaire de parasites extracellulaires 11. Cette méthode n&#39;a pas non plus générer des mutants conditionnels résultant de phénotypes faibles. La méthode décrite ici surmonte le fort attachement de egressing parasites en incluant un concurrent glycane, le sulfate de dextrane (DS), qui empêche les parasites de coller à la cellule 19 hôte. En outre, les parasites extracellulaires sont spécifiquement tué par la pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), ce qui laisse des parasites intracellulairessains et saufs 20. Par conséquent, avec un nouvel écran phénotypique spécifiquement isoler des mutants de parasites avec les défauts de sortie induite, la puissance de la génétique peuvent désormais être pleinement déployé à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l&#39;évacuation cellule hôte.

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Transférer la génétique est une méthode puissante pour percer au niveau moléculaire de la façon dont<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Egresses de sa cellule hôte. Les protocoles sont fournis à chimiquement mutagénéiser parasites, d&#39;enrichir de mutants présentant des défauts dans l&#39;évacuation induite, et de valider le phénotype des mutants clonés.

Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

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Obtention hautement purifiée Toxoplasma gondii Les oocystes par un gradient de chlorure de césium discontinu

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