Name: cholesterol efflux assay
Uploaded: 2012-03-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד לבריאות ומחקר רפואי המועצה של אוסטרליה (NHMRC) (526615 ו - 545906) ו בין השאר על ידי תוכנית של ממשלת ויקטוריאני OIS. DS הוא בחור של NHMRC.

1. הכנת [3 H] כולסטרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונה קטר, לוותר על הסכום הנדרש של כולסטרול [3 H] לתוך צינור microfuge 1.5 מ&quot;ל (0.5 μCi (19 kBq) לכל גם נדרש assay אופייני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם [3 H]-כולסטרול הוא תלוי טולואן, לייבש אותו ל?...

<ol>
	<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+in+health+and+disease.">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+feedback:+from+Schoenheimer's+bottle+to+Scap's+MELADL.">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation:+basic+concepts+and+physiological+implications.">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li><li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response.">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li><li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages.">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li><li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li><li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+reconstituted+high-density+lipoprotein+leads+to+acute+changes+in+human+atherosclerotic+plaque.">Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque.</a> Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).</li><li>Kekulawala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+freezing+on+high-density+lipoprotein+functionality.">Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality.</a> Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).</li><li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure/Function+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides:+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein.">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li><li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport.">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li><li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo.">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li><li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux.">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li><li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+(caveolae.">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li><li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis.">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li><li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells.">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li><li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li></ol>

השיטה המתוארת למדוד בזרימת כולסטרול נועד למדוד את התנועה של כולסטרול מן התאים acceptor כולסטרול תאי. ישנם שיקולים קריטיים מספר בהבנה זו מתודולוגיה. Labelling ועל איזון המתודולוגיה המתוארת כולסטרול שכ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים \ תאים </td><td> הלה </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> השלם מדיה </td><td colspan="3"> RPMI - 10% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td><td> M199 - 5% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 1% סטרפטוקוקוס HEPES - 2% (1M) - 7% תוספת צמיחה תא האנדותל (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 10% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td></tr><tr><td> חינם מדיה בסרום </td><td colspan="3"> RPMI - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td><td> M199 - 1% L-גלוטמין - עט 1% סטרפטוקוקוס HEPES - 2% (1M) - תא האנדותל 7% לגדולה תוספת (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td></tr><tr><td> מעבר שיטה </td><td> 1 x טריפסין </td><td> השעיה </td><td> לגרד </td><td colspan="3"> 1 x טריפסין </td></tr><tr><td> מעבר יחס </td><td> 3:10 </td><td> 01:03 </td><td></td><td> 1:20 </td><td> 01:03 </td><td> 01:03 </td></tr><tr><td> הפעלת התא (לא חובה) </td><td></td><td colspan="5"> TO-901317 - LXR-אגוניסט - גמר קונצרט כלשהו. 4 מיקרומטר </td></tr><tr><td> אחרים ריאגנטים </td><td></td><td> phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA) - תא התמיינות - גמר קונצרט כלשהו. 0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterol efflux assay

תוכן כולסטרול בתאי יש לשמור בגבולות צרים מאוד, יותר מדי או מעט מדי כולסטרול בעוד כמה תוצאות תאים שיבוש של ממברנות הסלולר, אפופטוזיס ו נמק 1. תאים יכולים כולסטרול המקור סינתזה תאיים וממנה ליפופרוטאינים פלזמה, שני מקורות מספיקים כדי לספק את הדרישות באופן מלא של תאים כולסטרול. תהליכים של סינתזה ספיגת כולסטרול מוסדרים בחוזקה ליקויים של כולסטרול הן 2 נדיר. כולסטרול מופרזת היא בעיה נפוצה יותר 3. למעט hepatocytes וכן כמה תאים תואר adrenocortical, התאים אינם יכולים לבזות כולסטרול. לתאים יש שתי אפשרויות להפחתת כולסטרול התוכן שלהם: להמיר כולסטרול לתוך אסטרים cholesteryl, אופציה עם קיבולת מוגבלת כמו עומס יתר התאים עם אסטרים cholesteryl הוא גם רעיל, בזרימת כולסטרול, אפשרות בלתי מוגבלת עם יכולת פוטנציאלית. בזרימת כולסטרול הוא מפרטתהליך ific זה מוסדר על ידי מספר מובילי תאיים, כגון ה-ATP מחייב טרנספורטר קלטת חלבונים A1 (ABCA1) ו - G1 (ABCG1) ו הקולטן נבלות B1 סוג. Acceptor טבעי של כולסטרול בפלסמה הוא ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) אפוליפופרוטאין AI. Assay בזרימת כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית. הוא מודד את היכולת של התאים לשמור בזרימת כולסטרול ו / או את היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay מורכב מהשלבים הבאים. שלב 1: תיוג כולסטרול הסלולר באמצעות הוספת כולסטרול שכותרתו עד בינוני סרום המכיל ו דוגרים עם תאים של 24-48 שעות. צעד זה עשוי להיות משולב עם הטעינה של תאים עם כולסטרול. שלב 2: הדגירה של תאים בינוניים סרום ללא כולסטרול כדי לאזן בין כל שכותרתו בריכות כולסטרול תאיים. שלב זה עשוי להיות משולב עם הפעלת הסלולר CHolesterol מובילי. שלב 3: הדגירה של תאים עם acceptor תאי ו quantitation התנועה של כולסטרול שכותרתו מתאי כדי acceptor. אם מבשרי כולסטרול שימשו לתייג כולסטרול מסונתז החדש, שלב 1/4, טיהור של כולסטרול, ייתכן שיהיה צורך. Assay מספק את הפרטים הבאים: (א) כיצד טיפול מסוים (מוטציה, דפיקה למטה, ביטוי יתר או טיפול) משפיע על היכולת של התא כולסטרול בזרימת ו (ב) עד כמה את היכולת של acceptors פלזמה לקבל את הכולסטרול נגוע במחלה או טיפול. שיטה זו משמשת לעתים קרובות בהקשר של המחקר לב וכלי דם, הפרעות מטבוליות ו ניווניות, מחלות זיהומיות הרבייה.

Watch this Scientific Journal Video about Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

Cholesterol Efflux Assay

Assay כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית ואת היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay כולל תיוג תאים עם איזון כולסטרול, הכולסטרול בין בריכות תאיים ושחרור של כולסטרול כדי acceptor תאיים.

בזרימת כולסטרול Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Fundamentals

Chemistry of Life

SCIENTISTS IN ACTION

Experimental Metastasis Assay

גרורה ניסויית Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In vivo Assay שרירים כלב פונקציה

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

Spheroid Assay to Measure TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-induced Invasion

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

<em&gt; באוב</em&gt; CAM-assay כXenograftmodel לסרקומה

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

הדמיית הלבלב Neuroplasticity:<em&gt; במבחנה</em&gt; Dual-נוירון פלסטיות Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

דיפרנציאלית השפעות תרופות להורדת שומנים בדם להתכוונן מורפולוגיה של כולסטרול חלקיקים

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

תפוקה גבוהה התווית על-ידי Nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...