Name: cholesterol efflux assay
Uploaded: 2012-03-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) (526615 og 545906) og delvis av den viktorianske regjeringens OIS Program. DS er en kar av NHMRC.

1. Utarbeidelse av [3 H]-kolesterol <ol><li> I avtrekksskap, dispensere den nødvendige mengden av [3 H] kolesterol inn i en 1,5 ml microfuge tube (0,5 μCi (19 kBq) per brønn er nødvendig for en typisk analyse). </li><li> Hvis [3 H]-Kolesterol er suspendert i toluen, tørke den helt ned med N2 gass og resuspender med 100% etanol til en endelig konsentrasjon på 1 μCi (37 kBq / mL. Vortex og bland godt. </li></ol> 2. Kontaktflate Cells og merking Cellular Koles...

<ol>
	<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+in+health+and+disease.">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+feedback:+from+Schoenheimer's+bottle+to+Scap's+MELADL.">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation:+basic+concepts+and+physiological+implications.">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li><li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response.">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li><li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages.">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li><li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li><li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+reconstituted+high-density+lipoprotein+leads+to+acute+changes+in+human+atherosclerotic+plaque.">Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque.</a> Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).</li><li>Kekulawala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+freezing+on+high-density+lipoprotein+functionality.">Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality.</a> Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).</li><li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure/Function+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides:+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein.">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li><li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport.">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li><li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo.">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li><li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux.">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li><li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+(caveolae.">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li><li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis.">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li><li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells.">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li><li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li></ol>

Den beskrives metode for å måle kolesterol utstrømming er laget for å måle bevegelse av kolesterol fra cellene til en ekstracellulær kolesterol akseptor. Det er flere kritiske betraktninger i å forstå denne metoden. Merking og likevekt I den beskrevne metodikken merkede kolesterol legges til serum-holdig serum. Selv aldri undersøkt i detalj, er det antatt at kolesterol er innarbeidet i serum lipoproteiner og de er tatt opp av cellene. Det er viktig å gi ti...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenser \ Celler </td><td> Jakten </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> Komplette Media </td><td colspan="3"> RPMI - 10% FCS - 1% L-glutamin - 0,2% Pen strep </td><td> M199 - 5% FCS - 1% L-glutamin - 1% Pen strep - 2% HEPES (1m) - 7% endotelcelle vekst supplement (EKG) </td><td colspan="2"> DMEM - 10% FCS - 1% L-glutamin - 0,2% Pen strep </td></tr><tr><td> Serum Free Media </td><td colspan="3"> RPMI - 1% L-glutamin - 0,2% Pen strep </td><td> M199 - 1% L-glutamin - 1% Pen strep - 2% HEPES (1m) - 7% endotelcelle vokseth supplement (EKG) </td><td colspan="2"> DMEM - 1% L-glutamin - 0,2% Pen strep </td></tr><tr><td> Passage Metode </td><td> 1 x Trypsin </td><td> Suspensjon </td><td> Skrap </td><td colspan="3"> 1 x Trypsin </td></tr><tr><td> Passage Ratio </td><td> 03:10 </td><td> 01:03 </td><td></td><td> 01:20 </td><td> 01:03 </td><td> 01:03 </td></tr><tr><td> Celleaktivering (valgfritt) </td><td></td><td colspan="5"> TO-901317 - LXR-agonist - Final kons. 4 mM </td></tr><tr><td> Andre Reagenser </td><td></td><td> phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) - Celledifferensiering - Final kons. 0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterol efflux assay

Kolesterol innhold av celler må opprettholdes innenfor svært trange rammer, for mye eller for lite kolesterol i en celle resulterer i forstyrrelser av cellemembraner, apoptose og nekrose en. Celler kan kilde kolesterol fra intracellulær syntese og fra plasma lipoproteiner, begge kildene er tilstrekkelig til å tilfredsstille cellenes behov for kolesterol. Prosessene av kolesterol syntese og opptak er tett regulert og mangler av kolesterol er sjeldne to. Overdreven kolesterol er mer vanlig problem 3. Med unntak av hepatocytter og i noen grad adrenokortikal celler, celler ikke klarer å fornedre kolesterol. Celler har to alternativer for å redusere sitt kolesterol innhold: å konvertere kolesterol til kolesteryl estere, et alternativ med begrenset kapasitet som overbelastning celler med kolesteryl estere er også giftig, og kolesterol utstrømming, et alternativ med potensielt ubegrenset kapasitet. Utstrømming av kolesterol er en specific prosess som er regulert av en rekke intracellulære transportører, slik som ATP bindende kassett Transporter proteiner A1 (ABCA1) og G1 (ABCG1) og scavenger reseptor type B1. Den naturlige akseptor av kolesterol i plasma er høy density lipoprotein (HDL) og apolipoprotein AI. Den kolesterol utstrømming analysen er utformet for å quantitate frekvensen av kolesterol utstrømming fra dyrkede celler. Den måler antall celler til å opprettholde kolesterol utstrømming og / eller evne plasma akseptorer å akseptere kolesterol løslatt fra celler. Analysen består av følgende trinn. Trinn 1: merking cellulær kolesterol ved å legge merket kolesterol til serum-holdig medium og ruger med celler i 24-48 timer. Dette trinnet kan kombineres med lasting av celler med kolesterol. Trinn 2: inkubering av celler i serum-fri medium skal stabilisere merket kolesterol blant alle intracellulære kolesterol bassenger. Dette stadiet kan kombineres med aktivering av mobilnettet lmolesterol transportører. Trinn 3: inkubering av celler med ekstracellulært akseptor og kvantifisering av bevegelse av merket kolesterol fra cellene til akseptor. Dersom kolesterol forløpere ble brukt til å merke nylig syntetisert kolesterol, et fjerde trinn, rensing av kolesterol, kan kreves. Analysen gir følgende informasjon: (i) hvordan en bestemt behandling (en mutasjon, en knock-down, en overuttrykk eller en behandling) påvirker kapasiteten til cellen for å efflux kolesterol og (ii) hvordan kapasiteten til plasma akseptorer å akseptere kolesterol påvirkes av en sykdom eller en behandling. Denne metoden er ofte brukt i sammenheng med kardiovaskulær forskning, metabolske og nevrodegenerative lidelser, smittsomme og reproduktive sykdommer.

Watch this Scientific Journal Video about Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

Cholesterol Efflux Assay

Den kolesterol analysen er konstruert for å quantitate frekvensen av kolesterol utstrømming fra dyrkede celler og kapasitet på plasma akseptorer å akseptere kolesterol løslatt fra celler. Analysen består av merking celler med kolesterol, likevekt av kolesterol blant intracellulære bassenger og frigjøring av kolesterol til en ekstracellulær akseptor.

Kolesterol effluks Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Fundamentals

Chemistry of Life

SCIENTISTS IN ACTION

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

Spheroid Assay to Measure TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-induced Invasion

Spheroid Assay å måle TGF-β-indusert Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

En<em&gt; In vivo</em&gt; Assay til Test Blood Vessel Permeabilitet

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Den<em&gt; I ovo</em&gt; CAM-analysen som en Xenograftmodel for Sarkom

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulabukspyttkjertel Neuroplasticity:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-nevron Plasticity analysen

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tredimensjonale (3D) Tumor Spheroid invasjonen analysen

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Differensial virkningene av lipidsenkende legemidler i modulerende morfologi av kolesterol partikler

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Høy gjennomstrømming Nitrobenzoxadiazole-merket kolesterol middelklasseinnbyggere analysen

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...