Name: cholesterol efflux assay
Uploaded: 2012-03-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från National hälso-och Medical Research Council of Australia (NHMRC) (526.615 och 545.906) och dels av den viktorianska regeringens OIS Program. DS är en karl på NHMRC.

1. Framställning av [3H]-kolesterol <ol><li> I dragskåpet och dispensera den erforderliga mängden av [3H]-kolesterol i ett 1,5 ml mikrofugrör (0,5 pCi (19 kBq) per brunn krävs för en typisk analys). </li><li> Om [3H]-kolesterol suspenderas i toluen, torka den ned fullständigt med N2-gas och återsuspendera med 100% etanol till en slutlig koncentration av 1 ^ Ci (37 kBq / il. Vortex och blanda väl. </li></ol> 2. Plätering Celler och märkning Cellular Kole...

<ol>
	<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+in+health+and+disease.">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+feedback:+from+Schoenheimer's+bottle+to+Scap's+MELADL.">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation:+basic+concepts+and+physiological+implications.">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li><li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response.">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li><li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages.">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li><li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li><li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+reconstituted+high-density+lipoprotein+leads+to+acute+changes+in+human+atherosclerotic+plaque.">Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque.</a> Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).</li><li>Kekulawala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+freezing+on+high-density+lipoprotein+functionality.">Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality.</a> Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).</li><li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure/Function+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides:+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein.">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li><li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport.">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li><li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo.">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li><li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux.">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li><li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+(caveolae.">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li><li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis.">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li><li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells.">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li><li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li></ol>

Den beskrivna metoden för att mäta kolesterol utflöde är utformad för att mäta förflyttning av kolesterol ur celler till en extracellulär kolesterol-acceptor. Det finns flera viktiga faktorer för att förstå denna metod. Märkning och jämvikt I den beskrivna metoden märkt kolesterol tillsättes till serum-innehållande serum. Dock aldrig undersökts i detalj, antas det att kolesterol ingår i serum lipoproteiner och de tas upp av celler. Det är viktigt ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens \ Celler </td><td> HeLa </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> Komplett medium </td><td colspan="3"> RPMI - 10% FCS - 1% L-glutamin - 0,2% Pen Strep </td><td> M199 - 5% FCS - 1% L-glutamin - 1% Pen Strep - 2% HEPES (1M) - 7% endotelcellstillväxt supplement (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 10% FCS - 1% L-glutamin - 0,2% Pen Strep </td></tr><tr><td> Serumfria medier </td><td colspan="3"> RPMI - 1% L-glutamin - 0,2% Pen Strep </td><td> M199 - 1% L-glutamin - 1% Pen Strep - 2% HEPES (1M) - 7% Endotelcell växere tillägg (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 1% L-glutamin - 0,2% Pen Strep </td></tr><tr><td> Passage Metod </td><td> 1 x Trypsin </td><td> Suspension </td><td> Skrapa </td><td colspan="3"> 1 x Trypsin </td></tr><tr><td> Passage-förhållande </td><td> 3:10 </td><td> 01:03 </td><td></td><td> 1:20 </td><td> 01:03 </td><td> 01:03 </td></tr><tr><td> Cell Activation (tillval) </td><td></td><td colspan="5"> TO-901.317 - LXR-agonist - Final konc. 4 | iM </td></tr><tr><td> Andra reagens </td><td></td><td> forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) - Cell differentiering - Final konc. 0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterol efflux assay

Kolesterolhalten i celler måste upprätthållas inom mycket snäva gränser, för mycket eller för lite kolesterol i en cell resulterar i avbrott av cellmembran, apoptos och nekros 1. Celler kan källan kolesterol från intracellulär syntes och från plasma lipoproteiner, båda källorna är tillräckliga för att helt tillgodose cellernas krav på kolesterol. Processerna för kolesterolsyntes och upptag är hårt reglerad och bristerna hos kolesterol är sällsynta 2. Överdriven kolesterol är vanligare problem 3. Med undantag av hepatocyter och i viss utsträckning adrenokortikala celler, celler inte kan brytas ned kolesterol. Celler har två alternativ för att minska sin kolesterolhalt: att omvandla kolesterol till kolesterylestrar, ett alternativ med begränsad kapacitet som överbelasta cellerna med kolesterylestrar är också giftig, och kolesterol utflöde, ett alternativ med potentiellt obegränsad kapacitet. Kolesterol efflux är en specific process som regleras av ett antal intracellulära transportörer, såsom ATP-bindande kassett transportör proteiner A1 (ABCA1) och G1 (ABCG1) och elimineringsmedel receptortyp B1. Den naturliga acceptor av kolesterol i plasma är högdensitetslipoprotein (HDL) och apolipoprotein AI. Kolesterol utflöde analys är utformad för att kvantifiera graden av kolesterol utflöde från odlade celler. Den mäter kapaciteten hos celler att upprätthålla kolesterol utflöde och / eller kapaciteten hos plasmat acceptorer att acceptera kolesterol utlösts från celler. Analysen består av följande steg. Steg 1: märkning cellulär kolesterol genom att tillsätta märkt kolesterol till serum-innehållande medium och inkubera med cellerna under 24-48 timmar. Detta steg kan kombineras med lastning av celler med kolesterol. Steg 2: inkubation av celler i serumfritt medium till jämvikt märkt kolesterol hos alla intracellulära kolesterol pooler. Detta steg kan kombineras med aktivering av cellulära cholesterol transportörer. Steg 3: inkubation av celler med extracellulär acceptor och kvantifiering av flödet av märkt kolesterol från celler till acceptorn. Om kolesterol prekursorer användes för att märka nyligen syntetiserade kolesterol,, ett fjärde steg, rening av kolesterol kan erfordras. Analysen innehåller följande information: (i) hur en viss behandling (en mutation, en knock-down, ett överuttryck eller en behandling) påverkar förmågan hos cellen att utflöde kolesterol och (ii) hur kapaciteten av plasma acceptorer att acceptera kolesterol påverkas av en sjukdom eller en behandling. Denna metod används ofta i samband med kardiovaskulär forskning, metabola och neurodegenerativa sjukdomar, infektionssjukdomar och reproduktiva sjukdomar.

Watch this Scientific Journal Video about Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

Cholesterol Efflux Assay

Kolesterol-analys är utformad för att kvantifiera graden av kolesterol utflöde från odlade celler och förmågan hos plasma-acceptorer att acceptera kolesterol utlösts från celler. Analysen består av märka celler med kolesterol, jämviktning av kolesterol hos intracellulära pooler och frisättning av kolesterol till en extracellulär acceptor.

Kolesterol Utflöde Analys

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Fundamentals

Chemistry of Life

SCIENTISTS IN ACTION

Experimental Metastasis Assay

Experimentell Metastas analys

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine muskelfunktion analys

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

En musmodell av hornhinnan Pocket-analys för Angiogenes Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

Spheroid Assay to Measure TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-induced Invasion

Sfäroid analys för att mäta TGF-β-inducerad Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

En<em&gt; In vivo</em&gt; Analys för att testa Permeabilitet blodkärl

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Den<em&gt; I ovo</em&gt; CAM-analys såsom en Xenograftmodel för Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simula Pancreatic Neuroplasticity:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neuron Plasticity analys

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tredimensionell (3D) Tumör Spheroid invasionsanalys

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Differentiella effekter av lipidsänkande läkemedel i modulerande morfologi av kolesterol partiklar

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-märkt kolesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...