Name: efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00
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Ce manuscrit est dédié à la mémoire du Dr Wang Wenlan qui est décédé le 26 mai 2011. Nous remercions le Dr Douglas A. Kerr pour avoir généreusement fourni les cellules HBG3 MES utilisées dans cette étude. Ce travail a été financé par Nemours, une subvention (2 RR016472-10) dans le cadre du programme de INBRE du National Center for Research Resources (NCRR), et un prix COBRE subvention de la NCRR (5 P20 RR020173-05) pour soutenir le Centre pour la recherche pédiatrique à l&#39;Hôpital Alfred I. duPont pour les enfants, Wilmington, Delaware, Etats-Unis.

1. Étape 1: Souris souches embryonnaires de culture cellulaire (MES) (Durée: 3 jours) 1. Plaqué primaire fibroblastes embryonnaires de souris (PMEF) <ol><li> Manteau quatre de 100 mm boîtes de culture tissulaire avec de la gélatine pour l&#39;adhésion PMEF. Ajouter 8 ml de solution de gélatine à 0,1% (StemCell Technologies) à chaque plat et laisser incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Retirer l&#39;excès de gélatine à partir de plats. Ne pas rincer la vaissel...

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons.">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li><li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25 (2011).</li><li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite.">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li><li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo.">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li><li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers.">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li><li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened.">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain.">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li></ol>

La qualité des cellules MES est le paramètre le plus critique pour la production efficace des neurones moteurs. MES cellules doivent être cultivées sur des PMEF pour prévenir une différenciation spontanée. Ajout d&#39;un FRV permet de maintenir les cellules MES dans un état indifférencié. Comme les cellules se divisent toutes les MES h 12-15, le milieu de culture devient rapidement épuisées et doivent être remplacés tous les jours. Activation efficace de la voie Shh est un para...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF moyennes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1% </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES moyennes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cell-qualifié FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Glutamax-je </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Nucléosides </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1% </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FRV </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Milieu de différenciation neurale </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES FBS Cult </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Mono-thio glycérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Caboche </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND moyennes (différenciation) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Secte Un moyen basal </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Le remplacement du sérum Knockout </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> SON Supplément-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> L&#39;acide ascorbique </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-je </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% en d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> La fibronectine </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Héparine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 pg / ml dans D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> L&#39;acide rétinoïque </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> EMD Chemicals </td><td> 566660 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND moyennes (la culture du motoneurone) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Secte Un moyen basal </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Le remplacement du sérum Knockout </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> SON Supplément-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> L&#39;acide ascorbique </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-je </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% en d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> La fibronectine </td><td> StemCTechnologies ell </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Héparine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 pg / ml dans D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = Non applicable. Tableau 1. PMEF et des médias pour la culture cellulaire ou la différenciation MES. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;Nom strong&gt; du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> 0,1% de gélatine </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornithine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> 0,1 mg / ml dans d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Laminine de souris </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 ug / ml dans du PBS </td></tr><tr><td> 0,25% / trypsine EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = Non applicable. Tableau 2. Réactifs pour revêtement et la dissociation.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

Différenciation directe de souches embryonnaires (ES) des cellules dans les neurones moteurs fonctionnels représente une ressource prometteuse pour étudier les mécanismes des maladies, afin de déceler de nouveaux composés médicamenteux, et à développer de nouvelles thérapies pour les maladies du motoneurone telles que l&#39;atrophie musculaire spinale (SMA) et la sclérose latérale amyotrophique ( SLA). De nombreux protocoles actuels utilisent une combinaison de l&#39;acide rétinoïque (AR) et Sonic Hedgehog (Shh) à différencier souches embryonnaires de souris (MES) dans les cellules neurones moteurs 1-4. Cependant, l&#39;efficacité de différenciation des cellules MES dans le motoneurone a seulement rencontré un succès modéré. Nous avons développé un protocole de différenciation des deux l&#39;étape 5 qui améliore considérablement l&#39;efficacité de différenciation par rapport aux protocoles actuellement établies. La première étape consiste à améliorer le processus en ajoutant neuralisation Noggin et les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF). Noggin est une protéine morphogénétique osseuse (BMP) antagoniste et est impliqué dans l&#39;induction neurale uneelon le modèle par défaut de la neurogenèse et les résultats dans la formation de motifs de neurones antérieure 6. FGF signalisation agit en synergie avec Noggin dans l&#39;induction de la formation du tissu neuronal par la promotion d&#39;une identité postérieure neurones 7-9. Dans cette étape, les cellules MES ont été sensibilisées avec Noggin, bFGF, et FGF-8 pendant deux jours pour promouvoir la différenciation vers des lignées de neurones. La deuxième étape consiste à induire la spécification des neurones moteurs. Noggin / FGF ont exposé des cellules ont été incubées avec MES RA et d&#39;un agoniste Shh, agoniste Smoothened (SAG), pour un autre 5 jours pour faciliter la génération de motoneurones. Pour surveiller la différenciation des neurones moteurs en MES, on utilise une lignée cellulaire dérivée d&#39;un ES eGFP souris transgénique exprimant sous le contrôle du promoteur spécifique des neurones moteurs HB9 1. L&#39;utilisation de ce protocole robuste, nous avons atteint 51 ± 0,8% de l&#39;efficacité de différenciation (n = 3, p &lt;0,01, t de Student-test) 5. Les résultats de immunofluorescencecoloration a montré que des cellules GFP + de expriment les marqueurs spécifiques, neurones moteurs Islet-1 et de la choline acétyltransférase (ChAT). Notre protocole de différenciation en deux étapes fournit un moyen efficace pour différencier les cellules MES dans les neurones moteurs spinaux.

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Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Nous avons développé un nouveau protocole pour améliorer l&#39;efficacité de la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris en neurones moteurs. Les cellules ES différenciées acquis motoneurones dispose comme en témoigne l&#39;expression de marqueurs neuronaux et des neurones moteurs en utilisant des techniques d&#39;immunohistochimie.

Différenciation efficace des cellules souches embryonnaires de souris dans les neurones moteurs

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

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Recherche

Biologie

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

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Différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (MES) Cellules utilisant la méthode de goutte suspendue

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

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Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

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Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

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Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

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Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

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Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

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