Name: efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00
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Dieses Manuskript ist dem Andenken von Dr. Wenlan Wang, der am 26. Mai 2011 verabschiedet gewidmet. Wir danken Dr. Douglas A. Kerr für die großzügige Bereitstellung der HBG3 mES Zellen in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde von Nemours finanziert wird, ein Zuschuss (2 RR016472-10) unter der INBRE Programm des National Center for Research Resources (NCRR) und einem Cobre Gewährung von Finanzhilfen aus dem NCRR (5 RR020173 P20-05) an das Zentrum für Unterstützung Pädiatrische Forschung an der Alfred I. DuPont Hospital for Children, Wilmington, Delaware, USA.

1. Schritt 1: embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Cell Culture (Timing: 3 Tage) 1. Ausplattieren primäre embryonale Maus-Fibroblasten (PMEF) <ol><li> Coat vier 100-mm Zellkulturschalen mit Gelatine für PMEF Haftung. 8 ml von 0,1% Gelatine-Lösung (StemCell Technologies) zu jeder Schale und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Gelatine von Gerichten. Nicht spülen das Geschirr. </li><li> Verdünnen Sie ein Fläschchen mit Mitomycin C-inakt...

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons.">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li><li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25 (2011).</li><li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite.">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li><li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo.">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li><li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers.">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li><li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened.">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain.">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li></ol>

Die Qualität der mES Zellen ist die kritischen Parameter zur effizienten Erzeugung von Motoneuronen. mES Zellen müssen auf PMEF kultiviert werden, um spontane Differenzierung zu verhindern. Die Zugabe von LIF hilft bei der Erhaltung der die MES-Zellen in einem undifferenzierten Zustand. Als MES-Zellen teilen sich alle 12 bis 15 h wurde das Kulturmedium verarmt rasch und muss täglich ersetzt werden. Effiziente Aktivierung des Shh-Weg ist ein kritischer Parameter benötigt, um Motoneuronen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF Medium </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1% </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> mES Medium </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES-Zell-Qualifizierte FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Nucleosides </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1% </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Neuronale Differenzierung Medium </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cult FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Mono-thio Glycerin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Birne </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND Medium (Differenzierung) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Basal Medium-A </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 Ergänzung </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ITS Supplement-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% in D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07159 </td><td> 5 pg / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 ug / ml in D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Retinsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> EMD Chemicals </td><td> 566660 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND Medium (Motor Neuron Kultur) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Basal Medium-A </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 Ergänzung </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ITS Supplement-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% in D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07159 </td><td> 5 pg / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 ug / ml in D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = Nicht anwendbar. Tabelle 1. PMEF und Medien für MES-Zellkultur oder Differenzierung. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;strong&gt; Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 0,1% Gelatine </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornithin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> 0,1 mg / ml in D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Mauslaminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 pg / ml in PBS </td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin / EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = Nicht anwendbar. Tabelle 2. Reagenzien für die Beschichtung und Dissoziation.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

Direkte Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ES)-Zellen in funktionelle Motoneuronen stellt eine viel versprechende Quelle für Krankheiten Mechanismen zu studieren, zu neuer Wirkstoffe zu screenen und zu neuen Therapien für Motoneuronen-Krankheiten wie zum Beispiel Spinale Muskelatrophie (SMA) und Amyotrophe Lateralsklerose entwickeln ( ALS). Viele aktuelle Protokolle verwenden eine Kombination von Retinsäure (RA) und Sonic Hedgehog (Shh) an embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen in Motoneuronen 4.1 differenzieren. Allerdings ist die Effizienz der Differenzierung mES Zellen in Motoneuronen nur mit mäßigem Erfolg erfüllt. Wir haben eine zweistufige Differenzierung Protokoll Nr. 5, das verbessert die Differenzierung Effizienz im Vergleich zu derzeit etablierten Protokollen entwickelt. Der erste Schritt besteht darin, die neuralization durch Zugabe von Noggin und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) erweitern. Noggin ist ein knochenmorphogenetisches Protein (BMP)-Antagonisten und in Neuralinduktion gebracht einach der Standard-Modell der Neurogenese und führt zur Bildung der vorderen neuronalen Strukturieren 6. FGF wirkt synergistisch mit Noggin bei der Induktion von Nervengewebe Bildung durch die Förderung einer hinteren neuronalen Identität 9.7. In diesem Schritt wurden mES Zellen mit Noggin, bFGF und FGF-8 für zwei Tage grundiert werden, um neuronale Differenzierung in Richtung Linien zu präsentieren. Der zweite Schritt besteht darin, Motoneuronen-Spezifikation zu induzieren. Noggin / FGFs ausgesetzt mES Zellen wurden mit RA und einer Shh-Agonisten, Agonisten Smoothened (SAG), für weitere 5 Tage inkubiert, um Motoneuronen Generation zu erleichtern. Um die Differenzierung von MES in die Motor-Neuronen zu beobachten, verwendeten wir eine ES-Zelllinie von einer transgenen Maus exprimiert eGFP unter der Kontrolle des Promotors Motoneuronen Hb9 1 abgeleitet. Mit diesem robusten Protokoll erzielten wir 51 ± 0,8% der Differenzierung Effizienz (n = 3, p &lt;0,01, Student t-Test) 5. Die Ergebnisse der ImmunfluoreszenzFärbung zeigte, dass GFP +-Zellen die Motoneuronen spezifische Marker, Islet-1 und Cholin Acetyltransferase (ChAT) auszudrücken. Unsere Zwei-Schritt-Protokoll Differenzierung bietet eine effiziente Möglichkeit an MES-Zellen in spinalen motorischen Neuronen zu differenzieren.

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Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Wir entwickelten ein neues Protokoll, um die Effizienz der in vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen zu verbessern. Die differenzierten ES-Zellen erworbenen motorischen Neuronen verfügt wie durch die Expression von neuronalen und motorischen Neurons Marker mit Hilfe von immunhistochemischen Techniken nachgewiesen.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Forschung

Biologie

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differenzierung von Newborn Mäusehaut Derived Stem Cells in Germ-like Cells<em&gt; In-vitro-</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...