Name: efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00
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この原稿は2011年5月26日に亡くなった博士Wenlan王の記憶に捧げられています。我々は寛大に本研究で用いたHBG3 MES細胞を提供するために博士はダグラスA.カーに感謝します。この作品は、ヌムールによって資金を供給され、研究資源のナショナルセンター（NCRR）、およびセンターをサポートするNCRRからCOBRE助成賞（5 P20 RR020173-05）のINBREプログラムの下で助成金（2 RR016472-10）子供たちは、ウィルミントン、デラウェア州、アメリカ合衆国のためにアルフレッドI.デュポン病院で小児研究。

1。ステップ1：マウス胚性幹（MES）細胞培養（タイミング：3日間） 1。めっきの主マウス胎児線維芽細胞（PMEF） <ol><li> PMEF接着のためにゼラチンでコート4 100 mmの組織培養皿。各ディッシュに0.1％ゼラチン溶液（StemCell Technologies）を8 mlを加え、室温で30分間インキュベートする。 </li><li>料理からゼラチンの過剰を削除します。お皿を洗わない。 </li><li>約が含まれている?...

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons.">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li><li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25 (2011).</li><li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite.">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li><li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo.">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li><li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers.">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li><li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened.">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain.">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li></ol>

MES細胞の質が運動ニューロンの効率的な生成のための最も重要なパラメータです。 MESの細胞は、自発的な分化を防止するためにPMEFで栽培する必要があります。 LIFの添加により、未分化状態のMES細胞を維持するのに役立ちます。 MESの細胞はすべての12から15時間を分割するので、培地は急速に枯渇し、毎日交換する必要がありますとなります。 ソニックヘッジホッグ経?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> PMEF </td><td>ミリポア</td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF培地 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 16140-071 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030-081 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15240-063 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td></td><td></TD&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES培地 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES細胞修飾FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 16141-079 </td><td> 15パーセント</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ヌクレオシド</td><td>ミリポア</td><td> ES-008-D </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア</td><td> ES-007-E </td><td> 0.1mMの</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ミリポア</td><td> TMS-AB2-C </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> LIF </td><td>ミリポア</td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 神経分化培地 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ESカルトFBS </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 06905 </td><td> 15パーセント</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>モノチオグリセロール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M-6145 </td><td> 1mMの</td></tr><tr><td>頭</td><td>インビトロジェン</td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / mlの</td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / mlの</td></tr><tr><td> bFGFの</td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND培地（分化） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-カルト基礎中期</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> N-2サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17502-048 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> ITSサプリメント-B </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07155 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07157 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ミリポア</td><td> TMS-AB2-C </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 Oで0.15パーセント</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07159 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H3149 </td><td> d 2は 20μg/ mlのH 2 O </td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア</td><td> ES-007-E </td><td> 0.1mMの</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> R-2625 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td>サグ</td><td> EMDケミカルズ</td><td> 566660 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND媒体（運動ニューロン培養） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-カルト基礎中期</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> N-2サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17502-048 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> ITSサプリメント-B </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07155 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07157 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ミリポア</td><td> TMS-AB2-C </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 Oで0.15パーセント</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td> StemCエル·テクノロジーズ</td><td> 07159 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H3149 </td><td> d 2は 20μg/ mlのH 2 O </td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア</td><td> ES-007-E </td><td> 0.1mMの</td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr></tbody></table> NA =非適用される。 表1。MESの細胞培養や分化のPMEFとメディア。 <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;試薬の強力な&gt;名前</td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> 0.1％ゼラチン</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td>ポリ-DL-オルニチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P0421 </td><td> dには0.1 mg / mlの2 H 2 O </td></tr><tr><td>マウスラミニン</td><td>ミリポア</td><td> CC095 </td><td> 2、PBS中のμg/ mlの</td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン/ EDTA </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td>アキュマックス</td><td>ミリポア</td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA =非適用される。 表2コーティングと解離用試薬。

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

機能的な運動ニューロンへの胚性幹（ES）細胞の直接分化は、病気のメカニズムを研究するための新しい薬剤化合物をスクリーニングするために、このような脊髄性筋萎縮症（SMA）および筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン疾患の新しい治療法を開発するための有望なリソースを表します（ ALS）。現在の多くのプロトコルは、運動ニューロン1月4日に、マウス胚性幹（MES）の細胞を区別するために、レチノイン酸（RA）とソニックヘッジホッグ（Shh）の組み合わせを使用します。しかし、運動ニューロンへのMES細胞の分化効率は中程度の成功を収めている。我々は大幅に現在確立されているプロトコルと比べて分化効率を向上させる二段階の分化プロトコル5を開発しました。最初のステップは、ノギンと線維芽細胞増殖因子（FGFの）を追加することによって、神経誘導プロセスを強化することです。ノギンは骨形成タンパク質（BMP）のアンタゴニストであると神経誘導に関与している前方神経パターニング6の形成におけるニューロン新生と結果のデフォルトのモデルにccording。 FGFシグナリングは、後部神経アイデンティティ7-9を促進することにより、神経組織の形成を誘導するノギンと相乗的に作用する。このステップでは、MESの細胞は、神経系統に向かって分化を促進するために二日間ノギン、bFGFを、とFGF-8でプライミングされた。第二段階では、運動ニューロンの仕様を誘導することである。ノギン/ FGFの露出したMESの細胞が運動ニューロンの生成を容易にするために、別の5日間、RAとShhのアゴニスト、Smoothenedのアゴニスト（SAG）とインキュベートした。運動ニューロンへの混乱の分化をモニターするために、我々は運動ニューロン特異的プロモーターHb9 1の制御下でEGFPを発現するトランスジェニックマウス由来のES細胞株を使用していました。この堅牢なプロトコルを使用して、我々は±分化効率の0.8％の51を達成した（n = 3、P &lt;0.01、スチューデントの t検定）5。免疫からの結果染色は、GFP +細胞は運動ニューロン特異的マーカー、膵島-1およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChATの）を発現することを示した。私たちの二段階分化プロトコルは、脊髄運動ニューロンにMESの細胞を区別するための効率的な方法を提供します。

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Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

我々は運動ニューロンにマウス胚性幹細胞のインビトロ分化の効率を改善するための新しいプロトコルを開発しました。として免疫組織化学的手法を用いてニューロンと運動ニューロンマーカーの発現によって証明機能を分化したES細胞は運動ニューロンを取得しました。

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹（MES）細胞のin vitroにおける分化

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

マウスES胚細胞の単離と導出

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

生殖様細胞に新生マウス皮膚由来幹細胞の分化<em&gt;インビトロ</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...