Name: efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00
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본 원고는 2011년 5월 26일 일에 돌아가셨 박사 Wenlan 왕의 기억에 전념하고 있습니다. 우리는 넉넉한 본 연구에 사용된 HBG3 MES 세포를 제공해 주셔서 박사 더글러스 A. 커 감사드립니다. 이 작품은 Nemours 추진하는 사업, 연구 자원을위한 국립 센터 (NCRR)을 위해 센터를 지원하는 NCRR에서 코브레 기금 수상 (5 P20 RR020173-05)의 INBRE 프로그램하에 부여 (2 RR016472-10) 어린이, 윌밍턴, 델라웨어, 미국의 알프레드 나 듀폰 병원 소아 연구.

1. 1 단계 : 마우스 배아 줄기 (MES) 세포 배양 (타이밍 : 3 일) 1. 도금 주 태아의 마우스 섬유아 세포 (PMEF) <ol><li> PMEF 부착을위한 젤라틴과 코트 넷 100-mm 조직 문화 요리. 각각의 접시에 0.1 % 젤라틴 용액 (StemCell 기술) 8 ML을 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. </li><li> 요리에서 젤라틴 초과를 제거합니다. 요리 린스하지 마십시오. </li><li> 약 포함되어 있습니다 Mitomycin C-inactivated PME...

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons.">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li><li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25 (2011).</li><li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite.">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li><li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo.">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li><li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers.">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li><li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened.">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain.">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li></ol>

MES 세포의 품질은 모터 뉴런의 효율적인 생성을위한 가장 중요한 매개 변수입니다. MES 전지는 자발적인 차별을 방지하기 위해 PMEF에서 재배되어야한다. 난생의 추가가 undifferentiated 상태에서 MES 세포를 유지하는 데 도움이됩니다. MES 세포마다 12-15 H를, 분열적으로 문화 매체가 급속히 고갈되고 매일 교체해야합니다. 쉬 경로의 효율적인 활성화 운동 신경 세포 사양을 유발하?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF 매체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td></td><td></TD&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES 매체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell 기술 </td><td> 36,250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES 세포 - 공인 FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> Nucleosides </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 MM </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 난생 </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 신경 분화 매체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell 기술 </td><td> 36,250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES 컬트 FBS </td><td> StemCell 기술 </td><td> 06,905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 모노-thio의 글리세롤 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> 소량 </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 NG / ML </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 국방부 매체 (차별) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-컬트 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 마네 혈청 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> ITS 보충-B </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,155 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,157 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O의 0.15 % </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,159 </td><td> 5 μg / ML </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H3149 </td><td> D 2 20 μg / ML H 2 O </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 MM </td></tr><tr><td> Retinoic 산성 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> R-2625 </td><td> 1 μm의 </td></tr><tr><td> 처짐 </td><td> EMD 화학 </td><td> 566,660 </td><td> 1 μm의 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 국방부 매체 (모터 뉴런의 문화) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-컬트 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 마네 혈청 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> ITS 보충-B </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,155 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,157 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O의 0.15 % </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> StemC내말이 맞지 기술 </td><td> 07,159 </td><td> 5 μg / ML </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H3149 </td><td> D 2 20 μg / ML H 2 O </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 MM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr></tbody></table> NA = 비 적용됩니다. 표 1. MES의 세포 배양이나 차별에 대한 PMEF와 미디어. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;시약의 강력한&gt; 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 젤라틴 0.1 % </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 폴리-DL-ornithine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P0421 </td><td> D에 0.1 밀리그램 / ML 2 H 2 O </td></tr><tr><td> 마우스 laminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 μg / PBS에서 ML </td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = 비 적용됩니다. 표 2. 코팅 및 분리를위한 시약.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

기능성 모터 뉴런으로 배아 줄기 (ES) 세포의 직접 분화는 질병 메커니즘을 공부하는 신약 화합물을 선별, 그러한 척수 근육 위축증 (SMA)과 루게릭병 (같은 운동 신경 세포 질환에 대한 새로운 치료법을 개발 유망 자원을 나타냅니다 ALS). 많은 현재의 프로토콜은 모터 뉴런 1-4로 마우스 배아 줄기 (MES) 세포를 차별화하는 retinoic 산성 (RA)와 소닉 고슴도치 (쉬)의 조합을 사용합니다. 그러나, 모터 뉴런에 MES 세포의 분화 효율은 어느 정도 성공을 만났다있다. 우리는 크게 현재 설립 프로토콜에 비해 분화 효율을 향상시키는 두 단계의 분화 프로토콜 5 개발했습니다. 첫 번째 단계는 머리와 fibroblast의 성장 요인 (FGFs)를 추가하여 neuralization 과정을 강화하는 것입니다. 소량은 뼈 morphogenetic 단백질 (BMP) 길항제이며 신경 유도에 연루되어neurogenesis와 앞부분은 신경 patterning 6 형성의 결과의 기본 모델 ccording. FGF 신호는 사후 신경 정체성 7-9를 홍보하여 신경 조직 형성을 유도에서 소량으로 synergistically 역할을합니다. 이 단계에서는 MES 세포는 신경 lineages쪽으로 분화를 촉진하기 위해 이틀 동안 소량, bFGF, 그리고 FGF-8로 끝났다되었다. 두 번째 단계는 모터 신경 세포 명세를 유도하는 것입니다. 소량 / MES 세포를 노출 FGFs는 모터 신경 세포 생성을 촉진하기 위하여 앞으로 5 일 동안 RA와 쉬 작용제, Smoothened 작용제 (처짐)로 incubated했다. 모터 뉴런으로 혼란의 분화를 모니터링하기 위해, 우리는 모터 신경 세포 특정 발기인 Hb9 1의 제어하에 유전자 변형 마우스를 표현 eGFP에서 파생 ES 세포주를 사용했습니다. 이 강력한 프로토콜을 사용하여, 우리는 ± 분화 효율 0.8 %를 51 달성 (N = 3, P &lt;0.01, 학생의 T-테스트) 5. immunofluorescent의 결과염색법은 GFP + 세포가 운동 신경 세포 특정 마커, 섬-1과 acetyltransferase 콜린을 (채팅) 표현하는 것으로 나타났다. 우리 두 단계의 차별화 프로토콜은 척추 운동 뉴런으로 MES 세포를 차별화하기위한 효율적인 방법을 제공합니다.

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Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

우리는 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 시험 관내 분화의 효율을 개선하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 차별 ES 전지는 모터 뉴런이 같은 immunohistochemical 기술을 사용의 연결 및 모터 신경 세포 마커의 표현에 의해 입증 기능을 인수했습니다.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

연구

생물학

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

공중 드롭 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 (MES) 세포의 체외 차별에

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...