Name: efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons at JoVE.com

Эта рукопись, посвященная памяти доктора Wenlan Ван, который скончался 26 мая 2011 года. Мы благодарим д-р Douglas A. Kerr для обеспечения щедро HBG3 ЭСК клетки, используемые в этом исследовании. Эта работа финансировалась Немур, Грант (2 RR016472-10) под INBRE программы Национального центра по исследованию ресурсов (NCRR), а награду Кобре грант NCRR (5 P20 RR020173-05) для поддержки центра Детская исследований Альфреда И. Дюпон больницы для детей, Уилмингтон, штат Делавэр, США.

1. Шаг 1: мышь эмбриональных стволовых (ЭСК) культуры клеток (сроки: 3 дня) 1. Нанесение первичного эмбриональных фибробластов мыши (ПМЭФ) <ol><li> Пальто четыре 100-мм культуры тканей блюда с желатином для адгезии ПМЭФ. Добавить 8 мл 0,1% раствора желатина (StemCell технологий) для каждо?...

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons.">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li><li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25 (2011).</li><li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite.">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li><li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo.">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li><li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers.">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li><li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened.">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain.">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li></ol>

Качество ЭСК является наиболее важным параметром для эффективного производства моторных нейронов. ЭСК клетки должны быть выращены на ПМЭФ для предотвращения спонтанной дифференцировки. Добавление LIF помогает поддерживать ЭСК клетки в недифференцированное состояние. Как ЭСК клетки ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Конечная концентрация </td></tr><tr><td> ПМЭФ </td><td> Millipore </td><td> ПМЭФ-H </td><td> Не Доступно </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ПМЭФ среднего </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> Не Доступно </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-глютамин </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Пенициллина / стрептомицина </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1% </td></tr><tr><td></td><td></TD&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> ЭСК среднего </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell технологии </td><td> 36250 </td><td> Не Доступно </td></tr><tr><td> ES Cell-Квалифицированные FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> GlutaMax-я </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Номера для незаменимых аминокислот </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Нуклеозиды </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1% </td></tr><tr><td> β-меркаптоэтанол </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 мМ </td></tr><tr><td> Пенициллина / стрептомицина </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 нг / мл </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Нейронные среднего Дифференциация </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell технологии </td><td> 36250 </td><td> Не Доступно </td></tr><tr><td> ES Культ FBS </td><td> StemCell технологии </td><td> 06905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Номера для незаменимых аминокислот </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Моно-тио глицерина </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Башка </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 нг / мл </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 нг / мл </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 нг / мл </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> МНД среды (дифференциации) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-культ базальной среднего </td><td> StemCell технологии </td><td> 5801 </td><td> Не Доступно </td></tr><tr><td> Нокаут сыворотки замена </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 дополнения </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ЕЕ Дополнение-B </td><td> StemCell технологии </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Аскорбиновая кислота </td><td> StemCell технологии </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Пенициллина / стрептомицина </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> GlutaMax-я </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-глюкозы </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% в D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Фибронектин </td><td> StemCell технологии </td><td> 07159 </td><td> 5 мкг / мл </td></tr><tr><td> Гепарин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 мкг / мл в D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-меркаптоэтанол </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 мМ </td></tr><tr><td> Ретиноевой кислотой </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 мкМ </td></tr><tr><td> САГ </td><td> EMD химическими веществами </td><td> 566660 </td><td> 1 мкМ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> МНД среды (двигательный нейрон культуры) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-культ базальной среднего </td><td> StemCell технологии </td><td> 5801 </td><td> Не Доступно </td></tr><tr><td> Нокаут сыворотки замена </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 дополнения </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ЕЕ Дополнение-B </td><td> StemCell технологии </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Аскорбиновая кислота </td><td> StemCell технологии </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Пенициллина / стрептомицина </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> GlutaMax-я </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-глюкозы </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% в D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Фибронектин </td><td> StemCлокоть технологии </td><td> 07159 </td><td> 5 мкг / мл </td></tr><tr><td> Гепарин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 мкг / мл в D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-меркаптоэтанол </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 мМ </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 нг / мл </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 нг / мл </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 нг / мл </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 нг / мл </td></tr></tbody></table> NA = не применимо. Таблица 1. ПМЭФ и средств массовой информации для ЭСК клеточных культур или дифференциации. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;Строгое имя&gt; реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Конечная концентрация </td></tr><tr><td> 0,1% желатина </td><td> StemCell технологии </td><td> 07903 </td><td> Не Доступно </td></tr><tr><td> Поли-DL-орнитин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> 0,1 мг / мл в D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Мышь ламинин </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 мкг / мл в PBS </td></tr><tr><td> 0.25% трипсин / ЭДТА </td><td> StemCell технологии </td><td> 07901 </td><td> Не Доступно </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> Не Доступно </td></tr></tbody></table> NA = не применимо. Таблица 2. Реагенты для покрытия и диссоциации.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

Прямая дифференциации эмбриональных стволовых (ЭС) клеток в функциональных двигательных нейронов представляет собой перспективный ресурс для изучения механизмов болезни, для отбора новых соединений, лекарственных средств и разработать новые методы лечения для моторных нейронов заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия (СМА) и бокового амиотрофического склероза ( ALS). Многие современные протоколы используют комбинацию ретиноевая кислота (RA) и звуковой еж (Тсс), чтобы отличить мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в моторные нейроны 1-4. Тем не менее, дифференциация эффективности ЭСК в моторные нейроны только встретился с умеренным успехом. Мы разработали два шага дифференциации протокол 5, что значительно повышает эффективность дифференциации в настоящее время по сравнению с установленными процедурами. Первый шаг заключается в повышении neuralization процесс, добавив Noggin и фибробластов ростовыми факторами (FGFs). Noggin представляет собой белок, костные морфогенетические (BMP) антагонист и участвует в нервной индукцииccording по умолчанию модель нейрогенеза и приводит к образованию передних нейронные паттерны 6. FGF сигнализации действует синергически с Noggin в стимулировании формирования нейронной ткани путем содействия задней нейронной идентичности 7-9. На этом этапе ЭСК клетки загрунтовать Noggin, bFGF и FGF-8 в течение двух дней, чтобы способствовать дифференциации на нейронных линий. На втором этапе, чтобы побудить двигательных нейронов спецификации. Noggin / FGFs подвергаются ЭСК клетки инкубировали с РА и Shh агонист, сглаженным агонистов (SAG), в течение еще 5 дней для облегчения двигательных нейронов поколения. Для контроля за дифференциацию беспорядок в моторные нейроны, мы использовали линию ES клетки, полученные из трансгенных мышей выражения EGFP под контролем двигательных нейронов конкретных промоутер Hb9 1. Используя этот надежный протокол, мы достигли 51 ± 0,8% дифференциация эффективности (п = 3, р &lt;0,01, Стьюдента-тест) 5. Результаты иммунофлуоресцентногоокрашивание показало, что GFP + клеток выразить двигательных нейронов специфических маркеров, остров-1 и холинацетилтрансферазы (чат). Наш двухступенчатый дифференциации протокол обеспечивает эффективный способ дифференцировать ЭСК клетки в спинном моторных нейронов.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons at JoVE.com

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Мы разработали новый протокол для повышения эффективности экстракорпорального дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны. Дифференцированных клеток ES приобретенные моторные нейроны есть о чем свидетельствует выражение нейронов и двигательных нейронов маркеров использованием иммуногистохимических методов.

Эффективное Дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

В пробирке Дифференциация Мышь эмбриональных стволовых (MES) ячеек с использованием висячей капли Метод

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Выделение и Вывод мышиных эмбриональных зародышевых клеток

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в олигодендроцитов прекурсоров

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав Сердечная Прекурсоры и кардиомиоциты из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов подходит для культивирования эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Генерация Мыши, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Быстрая и эффективная генерация нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных в Multititre Формат плиты

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Дифференциация новорожденных кожи мышей стволовые клетки в зародышевые-подобных клеток<em&gt; В пробирке</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Ретровирусная Заражение мышиной эмбриональных стволовых клеток клетки, полученные из эмбриональных орган для анализа кроветворной дифференциации

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...