Name: efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons at JoVE.com

Detta manuskript är tillägnad minnet av Dr Wenlan Wang som gick bort den 26 maj 2011. Vi tackar dr Douglas A. Kerr för generöst tillhandahålla HBG3 MES celler som används i denna studie. Detta arbete har finansierats av Nemours, ett bidrag (2 RR016472-10) under INBRE programmet för National Center for Research Resources (NCRR) och en Cobre för beviljande av bidrag från NCRR (5 P20 RR020173-05) för att stödja Centrum för Pediatric Forskning vid Alfred I. duPont Barn-, Wilmington, Delaware, USA.

1. Steg 1: Mouse embryonala stamceller (MES) Cell Culture (Timing: 3 dagar) 1. Plätering primära embryonala fibroblaster från mus (PMEF) <ol><li> Coat fyra 100-mm vävnadsodlingsskålar rätter med gelatin för PMEF vidhäftning. Tillsätt 8 ml 0,1% gelatinlösning (StemCell Technologies) till varje skål och inkubera under 30 min vid rumstemperatur. </li><li> Ta bort överflödigt gelatin från rätter. Skölj inte disken. </li><li> Späd en flaska Mitomycin C-inaktiverat PMEF (Millipore)...

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons.">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li><li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25 (2011).</li><li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite.">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li><li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo.">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li><li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers.">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li><li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened.">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain.">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li></ol>

Kvaliteten av MES-celler är den mest kritiska parametern för effektiv generering av motomeuroner. MES celler måste odlas på PMEF att förhindra spontan differentiering. Tillsats av LIF hjälper till att upprätthålla de MES-celler i ett odifferentierat tillstånd. Som MES celler delar varje 12-15 h, odlingsmediet blir slut snabbt och måste bytas dagligen. Effektiv aktivering av Shh reaktionsvägen är en kritisk parameter som krävs för att inducera motorneuron-specifikationen. Shh pr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Slutkoncentration </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF mediet </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1% </td></tr><tr><td></td><td></TD&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES-medium </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36.250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cell-Kvalificerad FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Icke-essentiella aminosyror </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Nukleosider </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1% </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Neural differentieringsmedium </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36.250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cult FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06.905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Icke-essentiella aminosyror </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Mono-tio glycerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Noggin </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND-medium (differentiering) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Basal Medium-A </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout serumersättning </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 komplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ITS Supplement-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Askorbinsyra </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glukos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% i d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.159 </td><td> 5 | ig / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 | ig / ml i D 2 H2O </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Retinsyra </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 pM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> EMD Chemicals </td><td> 566.660 </td><td> 1 pM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND medium (Motor Neuron kultur) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Basal Medium-A </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout serumersättning </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 komplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ITS Supplement-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Askorbinsyra </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glukos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% i d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCEll Technologies </td><td> 07.159 </td><td> 5 | ig / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 | ig / ml i D 2 H2O </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = Ej tillämpligt. Tabell 1. PMEF och medier för MES cellodling eller differentiering. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;strong&gt; Reagensets namn </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Slutkoncentration </td></tr><tr><td> 0,1% gelatin </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poly-DL-omitin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> 0,1 mg / ml i d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Muslaminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 | ig / ml i PBS </td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin / EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = Ej tillämpligt. Tabell 2. Reagens för beläggning och dissociation.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

Direkt differentiering av embryonala stamceller (ES-celler) till funktionella motoriska nervceller utgör en lovande källa för att studera sjukdomsmekanismer, att screena nya läkemedelssubstanser, och att utveckla nya behandlingar för motor neuron sjukdomar såsom spinal muskelatrofi (SMA) och amyotrofisk lateral skleros ( ALS). Många nuvarande protokoll använder en kombination av retinsyra (RA) och Sonic hedgehog (Shh) för att differentiera från mus embryonala stamceller (MES)-celler i motoriska neuroner 1-4. Har dock differentieringen effektiviteten i MES celler till motoriska neuroner endast mötas med måttlig framgång. Vi har utvecklat en två-stegs differentiering protokoll 5 som avsevärt förbättrar differentieringen effektivitet jämfört med för närvarande fastställda protokoll. Det första steget är att förbättra neuralization processen genom tillsats av noggin och fibroblasttillväxtfaktörer (FGF). Noggin är ett benmorfogenetiskt protein (BMP)-antagonist och är inblandad i neural induktion ennligt standard modell av neurogenes och resulterar i bildningen av främre neurala mönstring 6. FGF signalering fungerar synergistiskt med Noggin att framkalla nervvävnad bildas genom att främja en bakre neural identitet 7-9. I detta steg var MES-celler primade med noggin, bFGF, och FGF-8 i två dagar för att främja differentiering i riktning mot neurala cellinjer. Det andra steget är att förmå motorneuron specifikation. Noggin / FGF exponerade MES-celler inkuberades med RA och Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), för ytterligare 5 dagar för att underlätta motorneuron generation. Att övervaka differentiering av MES in motomeuroner, använde vi en linje ES-cell härledd från en transgen mus som uttrycker EGFP under kontroll av den motoriska neuron promotor HB9 1. Med denna robusta protokoll nådde vi 51 ± 0,8% av differentiering verkningsgrad (n = 3, p &lt;0,01, Students t-test) 5. Resultaten från immunfluorescerandefärgning visade att GFP + celler uttrycker de motoriska neuron specifika markörer, Islet-1 och kolinacetyltransferas (ChAT). Våra två steg differentiering protokollet ger ett effektivt sätt att differentiera MES celler i ryggmärgen motoriska nervceller.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons at JoVE.com

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Vi utvecklade ett nytt protokoll att förbättra effektiviteten av in vitro differentiering av mus embryonala stamceller i motoriska nervceller. De differentierade ES-cellerna förvärvade motoriska neuroner har, vilket framgår av uttryck av neuronala och motor neuron markörer med immunhistokemiska tekniker.

Effektiv Differentiering av embryonala stamceller från mus till Motorneuroner

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro-differentiering av Mouse embryonala stamceller (MES) celler med hängande släpp-metoden

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolering och Härledning av Mouse Embryonala Germinal celler

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Beredning av mus Embryonala Fibroblastceller Lämplig för odling av humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Snabb och effektiv generering av nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller i en Multititre Plate format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiering av nyfödda mus härledda hudens stamceller i Germ-liknande celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Retroviral infektion av murina embryonal stamcells Härstammar Embryoid kroppens celler för analys av hematopoetiska Differentiering

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...