Name: efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons at JoVE.com

Bu yazının May 26, 2011 tarihinde vefat Dr Wenlan Wang anısına adanmıştır. Biz cömertçe Bu çalışmada kullanılan HBG3 MES hücreler sağlamak için Dr Douglas A. Kerr teşekkür ederim. Bu çalışma Nemours tarafından finanse edildi, bir Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (NCRR) ve Merkezi desteklemek için NCRR bir Cobre hibe (5 P20 RR020173-05) INBRE program kapsamında hibe (2 RR016472-10) Çocuklar, Wilmington, Delaware, ABD için Alfred I. duPont Hastanesi Pediatrik Araştırma.

1. Adım 1: Fare Embriyonik Kök (MES) Hücre Kültürü (Zamanlama: 3 gün) 1. Kaplama birincil fare embriyonik fibroblast (PMEF) <ol><li> PMEF yapışması için jelatin ile kaplayın dört adet 100 mm doku kültürü yemekleri. Her bir çanak% 0.1 jelatin çözeltisi (StemCell Technologies) 8 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Yemeklerinden jelatin fazla çıkarın. Bulaşıkları durulama yapmayın. </li><li> Yaklaşık içeren Mitomisin C-inaktive...

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons.">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li><li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25 (2011).</li><li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite.">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li><li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo.">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li><li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers.">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li><li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened.">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain.">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li></ol>

MES hücrelerinin kalitesi motor nöron verimli bir kuşak için en önemli bir parametredir. MES hücreler spontan farklılaşmasını önlemek için PMEF yetişen gerekir. LIF eklenmesi farklılaşmadan devlet MES hücrelerin korunmasına yardımcı olur. MES hücreler her 12-15 saat, bölme olarak kültür ortamı hızla tüketilmiş hale gelir ve günlük olarak değiştirilmesi gerekir. Şşş yolunun Verimli aktivasyonu motor nöron özellikleri ikna etmek için gereken kritik bir para...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Hücre-Nitelikli FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> % 15 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Olmayan amino asitler </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Nükleosidlerin </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinir Farklılaşma orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cult FBS </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 06905 </td><td> % 15 </td></tr><tr><td> Olmayan amino asitler </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Mono-tiyo gliserol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Kafa </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MSB orta (farklılaşma) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Bazal Orta-A </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout serum yerine </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> N-2 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> ITS Ek-B </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07155 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07157 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O% 0.15 </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> D 2 içinde 20 ug / ml H2O </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Retinoik Asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 566660 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MSB orta (Motor Nöron kültürü) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Bazal Orta-A </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout serum yerine </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> N-2 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> ITS Ek-B </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07155 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07157 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O% 0.15 </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> D 2 içinde 20 ug / ml H2O </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = Non-uygulanabilir. Tablo 1. MES hücre kültürü veya farklılaşma için PMEF ve Medya. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;reaktifin strong&gt; Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Jelatin% 0.1 </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poli-DL-ornitin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> D 0.1 mg / ml 2 H2O </td></tr><tr><td> Fare laminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 mcg / ml PBS </td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin / EDTA </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = Non-uygulanabilir. Tablo 2. Kaplama ve ayrışma için Reaktifler.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

Fonksiyonel motor nöronların embriyonik kök (ES) hücreleri doğrudan farklılaşma, hastalık mekanizmaları incelemek için yeni ilaç bileşikleri taranması ve bu spinal müsküler atrofi (SMA) ve Amyotrofik lateral skleroz (gibi motor nöron hastalıkları için yeni tedaviler geliştirmek için bir umut kaynağı temsil ALS). Birçok mevcut protokoller motor nöronların 1-4 içine fare embriyonik kök (MES) hücreleri ayırt etmek için retinoik asit (RA) ve sonik kirpi (Sus) bir arada kullanabilirsiniz. Ancak, motor nöronların içine MES hücrelerin farklılaşması verimliliği sadece ılımlı bir başarı ile bir araya geldi. Şu anda önemli ölçüde standart prosedürlere göre farklılaşma etkinliğini arttırır iki adımlı bir farklılaşma protokolü 5 gelişmiştir. Birinci adımda Noggin ve fibroblast büyüme faktörleri (FGFs) ekleyerek neuralization işlemi arttırmaktır. Noggin bir kemik morfogenetik protein (BMP) antagonistidir ve nöral indüksiyon karışmış birnöron ve ön sinirsel desenlendirme 6 oluşumunda sonuçların varsayılan modeline ccording. FGF sinyal posterior nöral kimlik 7-9 teşvik ederek nöral doku oluşumuna sebep olarak Noggin ile sinerjik olarak hareket eder. Bu adımda, MES hücre soyları sinirsel doğru farklılaşmasını teşvik etmek için, iki gün süre ile Noggin, bFGF ve FGF-8 ile astarlanmış edildi. İkinci aşamada, motor nöron özellikleri elde edilmesini sağlanmaktadır. Noggin / MES hücreleri maruz FGFs motor nöron üretimi kolaylaştırmak için başka bir 5 gün süreyle RA ve bir Shh agonisti, düzeltilir agonisti (SAG) ile inkübe edildi. Motor nöron içinde MESS farklılaşma izlemek için, motor nöron özel yükseltici HB9 1 kontrolü altında, bir transjenik farenin ifade EGFP türetilmiş bir ES hücre dizisi kullanılabilir. Bu sağlam protokolü kullanarak, ± farklılaşma verimliliği% 0.8 51 elde (n = 3, p &lt;0.01, Student t-testi) 5. Immünofloresan elde edilen sonuçlar,boyama GFP + hücrelerin motor nöron spesifik belirteçler, Islet-1 ve asetil kolin (ChAT) olduğunu göstermiştir. Bizim iki adım farklılaşma protokolü spinal motor nöronların içine MES hücreleri ayırt etmek için etkili bir yol sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons at JoVE.com

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...