Name: primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue at JoVE.com

Gefinancierd door de intramurale programma aan de geüniformeerde diensten Universiteit.

1. Dissectie van neonatale rat hersenweefsel <ol><li> Chill Leibovitz L-15 geconditioneerde media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% pen / strep) tot 4 ° C. Warm kweekmedia (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine) tot 37 ° C. Bereid 4 60x15 mm petrischaaltjes met 4-5 ml van de geconditioneerde L-15 media op ijs. Steriliseer alle chirurgische instrumenten met 100% ethanol. </li><li> Spoel de P2 neonatale rap pups met 70% ethanol. (Neonatale jonge ratten tussen de P1-P5 kan gebruikt worden in dit protocol.) </li...

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain:+graded+response,+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function.">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li><li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+neurotrauma.">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li><li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration.">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li><li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease.">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li><li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity.">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li><li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function.">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li><li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro.">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia.">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture.">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:+immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li><li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity.">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li><li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase.">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li></ol>

Hoewel dit protocol wordt routinematig gebruikt om zuivere en gezonde microglia voor onderzoek experimenten te produceren, zal een zorgvuldige afweging van technische aspecten tijdens de kritieke delen van de procedure de variabiliteit te minimaliseren in de geïsoleerde microglia. In de eerste plaats tijdens de dissectie van het hersenweefsel van de neonatale rat, pups, het werken in een tijdig is nodig om hypoxische en ischemische schade aan het weefsel te minimaliseren. Het is echter ook belangrijk de meningitis bekl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Petrischalen </td><td> Fisher merk </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Sharp ontleden schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 7b tang-standaard tips, gebogen, 11cm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 tang-standaard tips, recht, 11 cm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml conische centrifugebuizen </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml serologische pipetten </td><td> Grenier Bio Een </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml serologische pipetten </td><td> Grenier Bio Een </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 micrometer steriele nylon cel zeef </td><td> Valk </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm2 weefselkweekflessen </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Minimaal essentieel Dulbecco&#39;s medium (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz&#39;s L-15-medium </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Foetale paarden serum </td><td> Visser </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100% ethanol </td><td> De Warner Graham Company </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing, 10X, pH 7,4 </td><td> Kwaliteit Biologische, inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X in steriel, gedestilleerd water </td></tr><tr><td> Biohazard zakken </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijk </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well celkweek platen met cellBIND oppervlak </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue

Microglia met ongeveer 12% van het totale cellulaire populatie in de hersenen van zoogdieren. Hoewel neuronen en astrocyten worden beschouwd als de belangrijkste celtypes van het zenuwstelsel, microglia een belangrijke rol spelen in de normale hersenfysiologie door het bewaken van weefsel voor vuil en ziekteverwekkers en onderhouden van homeostase in het parenchym via fagocytaire activiteit 1,2. Microglia worden geactiveerd tijdens een aantal van letsel en aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve ziekte, traumatisch hersenletsel, en het zenuwstelsel infectie 3. Onder deze activerende voorwaarden, microglia verhogen hun fagocytische activiteit, ondergaan morpohological en proliferatieve veranderingen, en het actief scheiden reactieve zuurstof en stikstof soorten, pro-inflammatoire cytokines en chemokines, vaak het activeren van een paracriene of autocriene lus 4-6. Aangezien deze microglia responsen bijdragen aan de ziekte pathogenese in neurologische aandoeningen, onderzoek gericht op microglia is gerechtvaardigd. Door de cellulaire heterogeniteit van de hersenen, is technisch moeilijk om voldoende microgliale monstermateriaal verkrijgen met hoge zuiverheid in in vivo experimenten. De huidige onderzoek naar de neuroprotectieve en neurotoxische functies van microglia vereisen een routine technische methode om consistent te genereren zuivere en gezonde microglia met voldoende rendement voor de studie. We presenteren, in tekst en video, een protocol om zuiver primaire microglia isoleren van gemengde glia culturen voor een verscheidenheid van stroomafwaartse toepassingen. Kortom, deze techniek maakt gebruik van gescheiden hersenweefsel van neonatale rat pups te produceren gemengde gliale celculturen. Na de gemengde gliale culturen te bereiken confluentie, worden primaire microglia mechanisch geïsoleerd van de cultuur door een korte duur van schudden. De microglia worden geplaat bij hoge zuiverheid voor experimenteel onderzoek. Het principe en het protocol van deze methodiek zijnbeschreven in de literatuur 7,8. Daarnaast zijn alternatieve methoden voor het primaire microglia isoleren goed 9-12 beschreven. Gehomogeniseerde hersenweefsel kan worden gescheiden door dichtheid gradiënt centrifugatie de primaire microglia 12 opleveren. De centrifugeren is gemiddelde lengte (45 min) en kan cellulaire schade en activering, alsmede, veroorzaken verrijkte microglia en andere cellulaire populaties. Een ander protocol is gebruikt om primaire microglia isoleren verschillende organismen bij langdurige (16 uur) schudden terwijl in cultuur 9-11. Na schudden, wordt de media supernatant gecentrifugeerd om microglia te isoleren. Deze langere twee-staps isolatie methode kan ook verstoren microgliale functie en activering. We voornamelijk gebruik maken van de volgende microglia isolatie-protocol in ons laboratorium voor een aantal redenen: (1) primaire microglia te simuleren in vivo biologie meer trouw dan vereeuwigd knaagdieren microglia cellijnen, (2) Nominale mechanische verstoring zo min mogelijk cellulaire disfunctie of activatie en (3) een voldoende opbrengst kan worden verkregen zonder passage van de gemengde gliale celculturen. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol hersenweefsel maakt gebruik van de neonatale rat pups te isoleren microglia en dat het gebruik van oudere ratten te isoleren microglia kan aanzienlijk het rendement, activering status, en functionele eigenschappen van geïsoleerde microglia beïnvloeden. Er is bewijs dat ouder is verbonden met microglia disfunctie, verhoogde neuroinflammatie en neurodegeneratieve aandoeningen, hebben tot nu eerdere studies gebruikt ex vivo volwassen microglia beter inzicht in de rol van microglia in neurodegeneratieve ziekten is waar veroudering belangrijke parameter. Echter, ex vivo microglia niet in cultuur gehouden worden voor langere tijd. Hierdoor wordt in dit protocol wordt de levensduur van primaire microglia in cultuur moet worden opgemerkt dat de microglia d gedragenifferently van volwassen microglia en in vitro studies dient zorgvuldig te worden overwogen wanneer vertaald naar een in vivo setting.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue at JoVE.com

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen voor<em&gt; In vitro</em&gt; Studie-en downstream-toepassingen.

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Genereren van organotypische Raft Culturen van primaire humane keratinocyten

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model van Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infectie in de Neonatale Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolatie van Sertoli cellen en peritubulaire Cellen van Rat Testikels

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...