Name: primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue at JoVE.com

Finansiert av egenutført programmet ved Uniformert Services University.

1. Disseksjon av Neonatal Rat hjernevev <ol><li> Chill Leibovitz L-15 klimaanlegg media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% penn / Strep) til 4 ° C. Varm kultur media (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin) til 37 ° C. Forbered 4 60x15 mm petriskåler med 4-5 ml av de betingede L-15 media på isen. Steriliser alle kirurgiske verktøy med 100% etanol. </li><li> Skyll P2 neonatale rap unger med 70% etanol. (Neonatal rotteunger alderen P1-P5 kan brukes i denne protokollen.) </li><li> Raskt halshugge en rotte valp m...

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain:+graded+response,+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function.">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li><li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+neurotrauma.">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li><li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration.">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li><li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease.">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li><li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity.">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li><li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function.">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li><li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro.">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia.">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture.">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:+immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li><li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity.">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li><li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase.">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li></ol>

Mens denne protokollen er rutinemessig utnyttes til å produsere ren og sunn microglia for forskning eksperimenter, vil en nøye vurdering av tekniske forhold i løpet av kritiske deler av prosedyren minimere variasjonen i den isolerte microglia. Først under disseksjon av hjernevev fra nyfødte rotteunger, arbeider i tide er nødvendig for å minske hypoksisk og iskemisk skade på vev. Men det er også viktig å fullstendig fjerne meningeal dekker fra hjernen under disseksjon, fordi tilstedeværelsen av hjernehinnene v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm petriskåler </td><td> Fisher merke </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Skarpe dissekere saks </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 7b tang-standard tips, buede, 11cm </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 tang-standard tips, rette, 11 cm </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml koniske sentrifugerør </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml serologiske pipetter </td><td> Grenier Bio One </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml serologiske pipetter </td><td> Grenier Bio One </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mikrometer steril nylon celle sil </td><td> Falcon </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 vevskulturstudier flasks </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco er minimal viktig medium (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz har L-15 medium </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serum </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal equine serum </td><td> Fisher </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100% Etanol </td><td> The Warner Graham Selskapet </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatbufret saltoppløsning, 10X, pH 7,4 </td><td> Kvalitet Biological, Inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X i sterilt, destillert vann </td></tr><tr><td> Biohazard poser </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> Hausser Scientific </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> 6-vel cellekultur plater med cellBIND overflate </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue

Microglia utgjør ca 12% av den totale mobilnettet befolkningen i hjernen hos pattedyr. Mens nevroner og astrocytes anses de viktigste celletypene i nervesystemet, microglia spille en betydelig rolle i normal hjerne fysiologi ved å overvåke vev for rusk og patogener og opprettholde homeostase i parenchyma via phagocytic aktivitet 1,2. Microglia aktiveres under en rekke skader og sykdom forhold, herunder nevrodegenerativ sykdom, traumatisk hjerneskade, og nervesystemet infeksjon tre. Under disse aktiverende forholdene, microglia øke phagocytic aktivitet, gjennomgår morpohological og proliferativ forandring, og aktivt skiller reaktive oksygen og nitrogen arter, pro-inflammatoriske chemokines og cytokiner, ofte aktivere en parakrine eller autocrine sløyfe 4-6. Ettersom disse microglial svar bidra til sykdom patogenesen i nevrologiske tilstander, fokusert forskning på microglia er berettiget. På grunn av den cellulære heterogenitet i hjernen, er det teknisk vanskelig å oppnå tilstrekkelig microglial prøvemateriale med høy renhet under in vivo eksperimenter. Aktuell forskning på de nervecellene og nevrotoksiske funksjoner microglia krever en rutine teknisk metode for å konsekvent generere ren og sunn microglia med tilstrekkelig kapasitet for studien. Vi presenterer i tekst og video, en protokoll for å isolere ren primære microglia fra blandede gliaceller kulturer for en rekke nedstrøms applikasjoner. Kort, benytter denne teknikken skilt hjernevev fra nyfødte rotteunger til å produsere blandede glial cellekulturer. Etter blandede glial kulturer nå confluency, er primære microglia mekanisk isolert fra kulturen ved en kort varighet av risting. De microglia blir deretter belagt med høy renhetsgrad for eksperimentell studie. Prinsippet og protokoll av denne metodikken har værtbeskrevet i litteraturen 7,8. I tillegg er alternative metoder for å isolere primære microglia godt beskrevet 9-12. Homogenisert hjernevev kan separeres ved tettshetsgradient sentrifugering å gi primær microglia 12. Imidlertid er det sentrifugering av moderat lengde (45 min) og kan forårsake cellulær skade og aktivisering, samt, føre beriket microglia og andre cellulære populasjoner. En annen protokoll er blitt brukt til å isolere primær microglia i en rekke organismer ved lengre (16 t) ristet mens i kultur 9-11. Etter risting er media supernatanten sentrifugere å isolere microglia. Dette lenger to-trinns isolasjon metoden kan også måner microglial funksjon og aktivisering. Vi hovedsakelig benytte følgende microglia isolasjon protokoll i vårt laboratorium for en rekke årsaker: (1) primær microglia simulere in vivo biologi mer trofast enn udødeliggjorde gnager microglia cellelinjer, (2) Nominell mekanisk forstyrrelse reduserer potensialet cellulær dysfunksjon eller aktivering, og (3) tilstrekkelig avkastning kan oppnås uten passasje av de blandede glial cellekulturer. Det er viktig å merke seg at denne protokollen bruker hjernevev fra nyfødte rotteunger å isolere microglia og at bruk av eldre rotter å isolere microglia kan ha betydelig innvirkning på avkastningen, aktivering status, og funksjonelle egenskaper av isolerte microglia. Det er dokumentert at aldring er koblet med microglia dysfunksjon, økt neuroinflammation og nevrodegenerative sykdommer, har så tidligere studier brukte ex vivo voksen microglia å bedre forstå den rollen microglia i nevrodegenerative sykdommer hvor aldring er viktig parameter. Imidlertid kan ex vivo microglia ikke holdes i kultur i lengre perioder av gangen. Derfor, mens denne protokollen forlenger livet til primære microglia i kultur, bør det bemerkes at microglia oppfører differently fra voksen microglia og in vitro studier bør vurderes nøye når oversatt til en in vivo setting.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue at JoVE.com

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Isolere primære microglia fra mobilnettet heterogenitet av hjernen er viktig å undersøke deres rolle i både fysiologiske og patologiske forhold. Denne protokollen beskriver en mekanisk isolering og blandet cellekultur teknikk som gir høy avkastning og høy renhet, levedyktige primære microglial celler for<em&gt; In vitro</em&gt; Studie-og nedstrøms applikasjoner.

Primær microglia Isolasjon fra Blandede glial cellekulturer fra Neonatal Rat hjernevev

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generering av Organotypic Raft Cultures fra primære humane keratinocytter

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrking Microglia fra Neonatal og voksne sentralnervesystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolering av Cortical Microglia med Bevarte Immunfenotype og funksjonalitet fra Murine Nyfødte

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasiv Model of Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infeksjon i Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolasjon og intravenøs injeksjon av murine Bone Marrow Avledet Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolering av Sertoli celler og Peritubular Celler fra Rat Testes

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...