Name: primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue at JoVE.com

Üniformalı Hizmetleri Üniversitesi intramural programı tarafından finanse edilmektedir.

1. Yenidoğan Rat Beyin Dokusu diseksiyonu <ol><li> Chill Leibovitz L-15 şartlandırılmış ortam (Leibowitz L-15 +% 0.1 BSA, 1 +% Pen / Strep) ile 4 ° C. Sıcak kültür ortamına (DMEM% 10 FBS + +% 1 penisilin / streptomisin) 37 ° C&#39;ye kadar Buz üzerinde klimalı L-15 medya 4-5 ml 4 60x15 mm Petri kapları hazırlayın. % 100 etanol ile tüm cerrahi aletleri sterilize edin. </li><li> % 70 etanol ile P2 yenidoğan rap yavrular durulayın. (P1-P5 arası Yenidoğan sıçan yavrularının bu protokolü kullanı...

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain:+graded+response,+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function.">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li><li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+neurotrauma.">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li><li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration.">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li><li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease.">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li><li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity.">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li><li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function.">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li><li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro.">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia.">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture.">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:+immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li><li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity.">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li><li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase.">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li></ol>

Bu protokol rutin araştırma deneyleri için saf ve sağlıklı mikroglia üretmek için kullanılır iken, prosedürün kritik parçalar sırasında teknik yönlerini dikkatle düşünülmesi izole mikroglia değişkenliği en aza indirecektir. İlk olarak, zamanında çalışan yenidoğan sıçanların yavrularının beyin dokusu, diseksiyon sırasında doku hipoksik ve iskemik hasarı en aza indirmek için gereklidir. Ancak, meninksler varlığı bu kültür şartlarında hızlı çoğalma hızı nedeniyle önemli f...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm petri </td><td> Fisher marka </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Keskin diseksiyon makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # kavisli 7b forseps standart ip uçları, 11cm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 forseps standart ipuçları, düz, 11 cm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konik bir santrifüj tüpünde </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml serolojik pipet </td><td> Grenier Bio Bir </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml serolojik pipet </td><td> Grenier Bio Bir </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mikron steril naylon hücre süzgecinden </td><td> Şahin </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 doku kültürü şişeleri </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco ortamı minimum gerekli (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 orta </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal at serumu </td><td> Balıkçı </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> % 100 etanol </td><td> Warner Graham Şirketi </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat 10X tuzlu su çözeltisi, pH 7.4 tamponlu </td><td> Kalite Biyolojik, inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> Steril distile su 1X </td></tr><tr><td> Biohazard çanta </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> Hausser Bilimsel </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> CellBIND yüzeyi ile 6-de hücre kültür plakaları </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue

Memeli beyninde toplam hücresel nüfusunun yaklaşık% 12 için mikroglia hesabı. Nöronlar ve astrositler sinir sisteminin önemli hücre tipleri kabul edilirken, mikroglia enkaz ve patojenler için doku izlenmesi ve fagositik aktivite 1,2 ile parankiminde homeostazı koruyarak normal beyin fizyolojisi önemli bir rol oynamaktadır. Mikroglia nörodejeneratif hastalıklar, travmatik beyin hasarı ve sinir sistemi enfeksiyonu 3 de dahil olmak üzere yaralanma ve hastalık, bir dizi sırasında aktive edilir. Bu aktive edici koşullar altında, mikroglia, bunların fagositik aktiviteyi artırır morpohological ve proliferatif değişikliğe uğrar ve aktif reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin, pro-inflamatuar kemokinler ve sitokinler salgılar, genellikle bir parakrin veya otokrin döngü 4-6 aktive. Bu mikroglial yanıtları nörolojik koşullarda hastalığı patogenezine katkıda gibi, araştırma m odaklandıicroglia garantilidir. Beynin hücresel heterojenite nedeniyle, in vivo deneyler sırasında yüksek saflıkta yeterli mikroglial örnek materyal elde etmek teknik olarak zordur. Mikroglia nöroprotektif ve nörotoksik fonksiyonları üzerine Mevcut araştırma tutarlı çalışması için yeterli verimi ile saf ve sağlıklı mikroglia üretmek için rutin bir teknik yöntem gerektirir. Biz, metin ve video, aşağı çeşitli uygulamalar için karışık glia kültürlerden saf primer mikroglia izole etmek için bir protokol mevcut. Kısaca, bu tekniğin karışık glial hücre kültürü üretmek için yenidoğan sıçanların yavrularının ayrışmış beyin dokusu kullanır. Karışık glial kültürler konfluent ulaştıktan sonra, primer mikroglia mekanik çalkalama kısa bir süre ile kültür izole edilir. Mikroglia sonra deneysel çalışma için yüksek saflıkta kaplanıyor. Bu yöntemin prensibi ve protokol olduLiteratürde 7,8 tarif. Buna ek olarak, birincil mikrogliya izole etmek için alternatif bir yöntem de 9-12 tarif edilmektedir. Homojenize beyin doku primer mikroglia 12 verim yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile ayrılabilir. Ancak, orta boy santrifüjleme (45 dakika) ve hücre hasar ve aktivasyonu, aynı zamanda, zenginleştirilmiş mikroglia ve diğer hücre popülasyonları neden neden olabilir. Başka bir protokol kültürünün çalkalama 9-11 iken (16 saat) uzamış organizmalar çeşitli primer mikroglia izole etmek için kullanılmıştır. Çalkalandıktan sonra, süpernatan ortam mikroglia izole etmek için santrifüje tabi tutulur. Bu işlem iki aşamalı bir yöntem ayrıca izolasyonu mikrogliyal fonksiyonu ve aktivasyon karıştırmayı olabilir. Biz esas nedenlerle bir dizi için laboratuvar aşağıdaki mikroglia izolasyon protokolü kullanır: (1) primer mikroglia (2, daha sadık ölümsüzleştirdi kemirgen mikroglia hücre hatları daha vivo biyoloji simüle) Nominal mekanik bozulma potansiyeli hücresel disfonksiyon veya aktivasyon en aza indirir, ve (3) yeterli verim karışık glial hücre kültürlerinin geçiş olmadan elde edilebilir. Bu protokol mikroglia yalıtmak için yenidoğan sıçanların yavrularının beyin dokusu kullanır ve mikroglia önemli ölçüde izole mikroglia verimi, aktivasyon durumu ve fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir izole etmek için büyük sıçan kullanarak bu dikkat etmek önemlidir. Yaşlanma mikroglia disfonksiyon, artmış nöro-inflamasyonu ve nörodejeneratif patolojileri ile bağlantılı olduğuna dair kanıtlar vardır, bu nedenle önceki çalışmalarda yaşlanmanın önemli bir parametre olduğu daha iyi nörodejeneratif hastalıklarda mikroglia rolünü anlamak için ex vivo yetişkin mikroglia kullandık. Bununla birlikte, ex vivo mikrogliya uzun süreler için kültür tutulması mümkün değildir. Bu protokolün bir kültürü primer mikroglianın ömrünü uzatır iken, bu nedenle, bu mikrogliya d davranırlar not edilmelidirin vivo ortamda bir tercüme ettiğimizde ifferently yetişkin mikroglia gelen ve in vitro çalışmalar dikkatle düşünülmelidir.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue at JoVE.com

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri açıklar<em&gt; In vitro</em&gt; Çalışma ve aşağı uygulamaları.

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

İlköğretim İnsan Keratinositler gelen Organotipik Radye Kültürlerin Üretimi

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Sıçan Testislerindeki Sertoli Hücreleri İzolasyon ve peritübüler Hücreler

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...