Name: engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (aav) gene therapy vectors via dna family shuffling
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00
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作者は感謝してハイデルベルク大学で優秀CellNetworksのクラスタで同様にチカとハインツシャラー（CHS）の基礎によって彼らのラボは、チームメンバーとの仕事の優れたサポートを認める。我々はDNAファミリーシャフリングを介して分子のAAVの進化は、三年前に我々の最初の出版以来、非常にアクティブなフィールドになるので、仕事に関連する出版物のすべての著者に謝罪しました感謝は、スペースの制約からここでは引用できませんでした。

1。 AAVキャプシド遺伝子をコードするプラスミドセットの準備<ol><li>その後のDNAシャッフリングのための様々なAAVキャプシド（ キャップ ）の遺伝子の十分な量の日常的な準備を容易にするために、最初に共通のプラスミドバックボーンにこれらの遺伝子をサブクローニング。 nested PCR法およびクローニングのためのプライマー結合部位（ 図2）として後で使用するために&...

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	<li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+virus+evolution+to+vector+revolution:+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+(AAV)+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy.">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes.">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses.">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li><li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li><li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li><li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"humanized"+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells.">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+(AAV-2)+capsid:+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection.">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA/short+hairpin+RNA+pathways.">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li><li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice.">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li><li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny.">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes:+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles.">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li><li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction.">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li><li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+(AAV)+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection.">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li><li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector:+directed+evolution+of+adeno-associated+virus.">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li><li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors.">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li><li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+gene+delivery+vectors:+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer.">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li><li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries.">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li><li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+(scAAV)+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis.">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li></ol>

ここでは、DNAシャフリングを介して家族や細胞や動物の進化に不可欠な実験の手順およびAAVキャプシドエンジニアリングのためのガイドラインを概説しています。本質的には、これらのプロトコルは、2008年3我々は最初のAAVのフィールド内で報告手順の標準化バージョンです。他の人の研究のフォローアップの突風は、多くの変更、 例えば 、10から13を報告し?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td>インビトロジェン</td><td> 18068-015 </td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン（PEI） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 408727 </td></tr><tr><td>制限酵素</td><td> NEB </td><td>さまざまな</td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td><td> NEB </td><td> M0202T </td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>キアゲン</td><td> 28704 </td></tr><tr><td>备考IIポリメラーゼキット</td><td> Finnzymes（NEB） </td><td> F-540S </td></tr><tr><td> HotStarハイファイポリメラーゼキット</td><td>キアゲン</td><td> 202602 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Finnzymes（NEB） </td><td> F-540S（キットの一部） </td></tr><tr><td> EDTA（25mM）の</td><td>インビトロジェン</td><td> 18068-015（キットの一部） </td></tr><tr><td>トリス</td><td>ロート</td><td> 4855.2 </td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>ロート</td><td> K029.2 </td></tr><tr><td>のdNTP（10mMの、100μl）を</td><td>インビトロジェン</td><td> 18427013 </td></tr><tr><td>イオジキサノール（OptiPrep） </td><td>軸シールド</td><td> 1114739 </td></tr><tr><td> Phenolred </td><td>メルク</td><td> 107241 </td></tr><tr><td>プラスミドメガ準備キット</td><td>キアゲン</td><td> 12181 </td></tr><tr><td>超遠心</td><td> Beckman-Coulter社</td><td>オプティマL90K </td></tr><tr><td>クイックシールの遠心チューブ</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> 342414 </td></tr><tr><td>エレクトロ·ユニット</td><td>バイオ·ラッド</td><td> GenePulserXcell </td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td> Vapo保護</td></tr><tr><td>加熱ブロック</td><td> BIOER </td><td> MB-102 </td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX81 </td></tr><tr><td> FACSアナライザ</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> Cytomics FC500 MLP </td></tr><tr><td> MegaX DH10B T1R細胞</td><td>インビトロジェン</td><td> C640003 </td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ</td><td>メルク</td><td> 101695 </td></tr><tr><td>アデノウイルス-5 </td><td> ATCC </td><td> VR-5 </td></tr><tr><td>プラスミドpBluescript II KS（+） </td><td>ストラタジーン</td><td> 212207 </td></tr><tr><td> cap5F（太字の黄色、cap5特異的配列のパック私のサイト）： GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC </td><td> IDTDNA </td><td>カスタムプライマー</td></tr><tr><td> cap5R（緑、太字でcap5特異的配列のASC Iサイト）： GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC </td><td> IDTDNA </td><td>カスタムプライマー</td></tr></tbody></table>

engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (aav) gene therapy vectors via dna family shuffling

アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、有益な特性の1のユニークな組み合わせにより、治療用ヒト遺伝子導入のための最も強力かつ有望な車両の一部を表しています。これらは、基礎となる野生型ウイルスと高力価、高純度、臨床グレードの組換えベクター2の生産のための高度な方法論のapathogenicityが含まれています。他のウイルス以上のAAVシステムの更なる特定の利点は、当然、まだすべて簡単に一般的なプロトコルの1,2を使用してベクトルとして操作することができる本質的な特性で異なる血清型に発生するの富の可用性です。また、私たち自身を含むグループの数は、最近、どちらか、複数の入力の血清型の資産、またはその分離、単一の特性を向上させるを組み合わせて合成ベクトルを作成するためのテンプレートとして、これらの天然のウイルスを使用するための戦略を考案した。これらの目標ARを実現するためにそれぞれの技術電子どちらDNA家族シャフ3、部分的相同性に基づいて再組み立てに続いて様々なAAVキャプシド遺伝子のつまり断片化（通常はほとんどのAAV血清型のために&gt; 80％）、またはペプチドディスプレイには通常7つのアミノ酸の4,5、 すなわち挿入ペプチドは、理想的に所望の細胞型への再ターゲティングを媒介ウイルスキャプシドの露出したループ。最大の成功のために、両方の方法は、約100万の異なるカプシド変異体のライブラリを生成するためにプロトコルがアップスケーリングされることにより、高スループットな方法で適用されます。各クローンは、その後多数の親ウイルスのユニークな組み合わせ（DNAシャフリングア​​プローチ）から構成されるか、同じウイルスのバックボーン（ペプチドディスプレイアプローチ）内の独特のペプチドが含まれています。その後の最後のステップでは、ほとんど、または選択プロセスの理想的なすべての要件を満たす個々のカプシドを濃縮するために、標的細胞上のそのようなライブラリの選択を繰り返します。後者は、好ましくは、櫛抗AAV抗体と反応するすべてのキャプシドのインスタンスを除去するための負の選択とそのような興味のある特定の細胞型の成長としてINES正圧、、、。この組み合わせは選択を生き残った合成キャプシドは、おそらく任意の天然AAV分離で発見されなかったであろう方法で、特定のアプリケーションのニーズと一致している可能性が高くなります。ここでは、DNAのファミリー2つの技術の理論と実験のより困難なようにメソッドをシャッフルに焦点を当てています。我々は、記述し、実証するシャッフルAAVライブラリの生成と選択（ 図1）の重要なすべての手順を実行し、次に1つのニーズは、分子AAVの進化を成功させるために注意すべきことのプロトコルの落とし穴や重要な側面について説明します。

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Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

我々は分子DNAファミリーシャフリングを介して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）の遺伝子治療ベクターを設計し、進化するための基本的なテクニックを示しています。さらに、一般的なガイドラインや文化やマウスの標的細胞上の強化されたプロパティを持つ個々のキメラキャプシドの選択と分析のための代表的な例を提供しています。

シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

テトラサイクリン調節細胞株は、具体的に樹状細胞を標的とする高力価レンチウイルスベクターを生成

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

の伝播<em&gt; Homalodisca coagulataウイルス01</em&gt;経由<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt;細胞培養

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...