Name: engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (aav) gene therapy vectors via dna family shuffling
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling at JoVE.com

Författarna erkänner tacksamt enastående stöd för deras lab, gruppmedlemmar och arbete med Cluster of Excellence CellNetworks i Heidelberg universitet samt med Chica och Heinz Schaller (CHS) Foundation. Vi uppskattar att molekylär AAV evolution via DNA familjen skyffling har blivit en mycket aktiv området sedan vår första publiceringen tre år sedan och därför be om ursäkt till alla som lämnat relevanta publikationer vars arbete inte kunnat citeras här på grund av det begränsade utrymmet.

1. Beredning av Plasmid Set kodar för AAV kapsidgener <ol><li> För att underlätta rutin framställning av tillräckliga mängder av de olika AAV-kapsid (CAP) gener för efterföljande DNA-skyffling, initialt subklona dessa gener in i en gemensam plasmidens ryggrad. Det är viktigt att inkludera identiska flankerande sekvenser av&gt; 20 nukleotider för senare användning som primerbindande ställen för innesluten PCR och för kloning (Fig. 2). </li><li> Användning av lämpliga primers (s...

<ol>
	<li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+virus+evolution+to+vector+revolution:+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+(AAV)+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy.">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes.">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses.">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li><li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li><li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li><li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"humanized"+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells.">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+(AAV-2)+capsid:+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection.">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA/short+hairpin+RNA+pathways.">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li><li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice.">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li><li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny.">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes:+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles.">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li><li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction.">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li><li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+(AAV)+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection.">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li><li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector:+directed+evolution+of+adeno-associated+virus.">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li><li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors.">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li><li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+gene+delivery+vectors:+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer.">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li><li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries.">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li><li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+(scAAV)+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis.">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li></ol>

Här har vi sammanställt viktiga experimentella åtgärder och riktlinjer för AAV-kapsiden engineering via DNA familjen skyffling och för evolutionen i celler eller i djur. I huvudsak dessa protokoll är standardiserade versioner av de förfaranden som vi först rapporteras inom AAV området år 2008 3. Medan en uppsjö av uppföljande studier av andra har rapporterat ett flertal modifikationer t.ex. 10-13, våra nuvarande versioner representerar grundläggande strategier som ger reprod...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DNas I </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 </td></tr><tr><td> Polyetylenimin (PEI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408.727 </td></tr><tr><td> Restriktionsenzymer </td><td> NEB </td><td> Olika </td></tr><tr><td> T4 DNA-ligas </td><td> NEB </td><td> M0202T </td></tr><tr><td> Gelextraheringskit </td><td> Qiagen </td><td> 28.704 </td></tr><tr><td> Phusion II polymeras Kit </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S </td></tr><tr><td> Hotstar Hifi-polymeras Kit </td><td> Qiagen </td><td> 202.602 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S (del av kit) </td></tr><tr><td> EDTA (25 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 (del av satsen) </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Roth </td><td> 4855,2 </td></tr><tr><td> Ampicillin natriumsalt </td><td> Roth </td><td> K029.2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM, 100 | il) </td><td> Invitrogen </td><td> 18427013 </td></tr><tr><td> Jodixanol (OptiPrep) </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114739 </td></tr><tr><td> Phenolred </td><td> Merck </td><td> 107.241 </td></tr><tr><td> Plasmid mega prep kit </td><td> Qiagen </td><td> 12.181 </td></tr><tr><td> Ultracentrifug </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Optima L90K </td></tr><tr><td> Quick-Seal centrifugrör </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 342.414 </td></tr><tr><td> Elektroporering enhet </td><td> Bio-Rad </td><td> GenePulserXcell </td></tr><tr><td> Termocykler </td><td> Eppendorf </td><td> Vapo Protect </td></tr><tr><td> Värmeblock </td><td> BIOER </td><td> MB-102 </td></tr><tr><td> Fluorescensmikroskop </td><td> Olympus </td><td> IX81 </td></tr><tr><td> FACS-analyseraren </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Cytomics FC500 MLP </td></tr><tr><td> MegaX DH10B-celler T1R </td><td> Invitrogen </td><td> C640003 </td></tr><tr><td> Benzonase </td><td> Merck </td><td> 101.695 </td></tr><tr><td> Adenovirus-5 </td><td> ATCC </td><td> VR-5 </td></tr><tr><td> pBlueScript II KS (+)-plasmid </td><td> Stratagene </td><td> 212.207 </td></tr><tr><td> cap5F (Pac I-stället i gult, cap5-specifika sekvenser i fetstil): GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC </td><td> IDTDNA </td><td> Anpassad primer </td></tr><tr><td> cap5R (Asc I-stället i grönt, cap5-specifika sekvenser i fetstil): GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC </td><td> IDTDNA </td><td> Anpassad primer </td></tr></tbody></table>

engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (aav) gene therapy vectors via dna family shuffling

Adenoassocierade virala (AAV) vektorer utgör några av de mest potenta och lovande vehiklar för terapeutiska humana genöverföring på grund av en unik kombination av fördelaktiga egenskaper 1. Dessa inkluderar apathogenicity av de underliggande vildtyp virus och de mycket avancerade metoder för produktion av hög titer, hög renhet och klinisk kvalitet rekombinanta vektorer 2. En ytterligare särskild fördel med AAV-systemet jämfört med andra virus är att det finns en stor mängd naturligt förekommande serotypema som skiljer sig i väsentliga egenskaper ännu kan alla lätt konstrueras som vektorer genom användning av ett vanligt protokoll 1,2. Dessutom har ett antal grupper, inklusive vår egen utarbetade nyligen strategier för att använda dessa naturliga virus som mallar för att skapa syntetiska vektorer som antingen kombinerar tillgångar av flera ingående serotyper, eller som förbättrar egenskaperna hos en enstaka isolat. De respektive teknik för att uppnå dessa mål are antingen DNA familjen shuffling 3, dvs fragmentering av olika AAV kapsidgener följt av deras återmontering baserad på partiella homologier (vanligtvis&gt; 80% för de flesta AAV serotyper) eller peptid display 4,5, dvs införande av vanligtvis sju aminosyror i en exponerad slinga av den virala kapsiden när peptiden helst medierar åter målsökning till en önskad celltyp. För maximal framgång, båda metoderna används i en hög genomströmning fashion där protokollen är upp-skalas för att ge bibliotek av omkring en miljon olika kapsid varianter. Varje klon sedan består av en unik kombination av flera föräldrar virus (DNA-omflyttning metod) eller innehåller ett distinkt peptid inom samma virala ryggraden (peptid visningsmetod). Det efterföljande sista steget är iterativ valet av ett sådant bibliotek på målceller för att berika enskilda capsids uppfyller de flesta eller helst alla krav i urvalsprocessen. Den senare företrädesvis kamInes positivt tryck, t.ex. tillväxt på en viss celltyp av intresse, med negativ selektion, till exempel avskaffande av alla kapsider reagerar med anti-AAV-antikroppar. Denna kombination ökar chanserna att syntetiska kapsidema överlever valet motsvarar behoven hos den given tillämpning på ett sätt som förmodligen inte skulle ha hittat på något naturligt förekommande AAV isolat. Här fokuserar vi på DNA-familjen blanda metod som teoretiskt och experimentellt mer utmanande av de två teknikerna. Vi beskriver och visa alla viktiga steg för generering och val av blandas AAV bibliotek (Fig. 1), och sedan diskutera fallgropar och kritiska aspekter av de protokoll som man behöver vara medveten om för att lyckas med molekylär AAV evolution.

Watch this Scientific Journal Video about Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling at JoVE.com

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Vi visar den grundläggande tekniken för att molekylärt konstruera och utveckla syntetiska Adeno-associerade virus (AAV) vektorer för genterapi via DNA-familjen skyffling. Dessutom ger vi allmänna riktlinjer och representativa exempel för urval och analys av enskilda chimärakapsider med förbättrade egenskaper på målceller i kultur eller möss.

Engineering och evolution av syntetisk Adeno-associerat virus (AAV) Gene Therapy Vektorer via DNA Familj Skyffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generering av Multivirus-specifika T-celler för att förhindra / behandla virusinfektioner efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Separation av enda DNA, dubbel-strängat DNA och RNA ur miljösynpunkt Viral gemenskapen med hjälp av hydroxyapatit Kromatografi

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion och Titering av rekombinanta Adeno-associerad virala vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Expanderande Cytotoxiska T-lymfocyter från navelsträngsblod att Target cytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, och adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

En Tetracyklin-reglerade cellinje ger hög-titer lentivirusvektorer som specifikt riktar dendritiska celler

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserade flödescytometri analys för att mäta cytotoxisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Förökning av<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel och effektiv strategi för att konstruera Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...