Name: measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay
Uploaded: 2012-09-09T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay at JoVE.com

وأيد هذا البحث مع صناديق التنمية المهنية والبحث العلمي بدء التشغيل من معهد جامعة اونتاريو للتكنولوجيا (UOIT) لA. الدكتور سامي جون والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة والصحة المهنية جائزة بحوث الطلاب لLevit إيرينا. الكتاب يعترف شانون ايفرت (التدريس والتعلم المركز، UOIT) لمساعدتها إعداد الفيديو. الكتاب يعترف الدكتور مايكل E. Nesheim (قسم الكيمياء الحيوية، جامعة كوينز، كينغستون، ON) لله النصح والإرشاد، والبصيرة، والمناقشات مفيدة. الكتاب نعترف أيضا الدكتور تشنغ توه هوك (رولد دال تخثر الدم والتخثر المركز ورويال مستشفى جامعة ليفربول، ليفربول، المملكة المتحدة) لتوفير البلازما المريض DIC التي استخدمت في الدراسة.

<ol>
	<li>Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factor+V+activation+paradox.">The factor V activation paradox.</a> J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).</li><li>Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+factor+Va+into+prothrombinase+is+required+for+coordinated+cleavage+of+prothrombin+by+factor+Xa.">Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa.</a> J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).</li><li>Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V.">Factor V.</a> Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).</li><li>Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+preparation+of+factor+V+deficient+plasma.">A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma.</a> Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V+cleavage+and+inactivation+are+temporally+associated+with+elevated+elastase+during+experimental+sepsis.">Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis.</a> J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+factors+associated+with+neutrophil+elastase+and+coagulation+in+intensive+care+patients+with+a+biphasic+waveform+and+disseminated+intravascular+coagulation.">Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).</li><li>Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+11+novel+mutations+in+patients+with+heterozygous+and+homozygous+FV+deficiency.">Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency.</a> Haemophilia. 16, 937-942 (2010).</li><li>Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-sandwich+enzyme+immunoassay+for+one-step+noncompetitive+detection+of+corticosteroid+11-deoxycortisol.">Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol.</a> Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).</li><li>Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+key+metabolic+enzyme+activities+in+mammalian+cells+using+rapid+and+sensitive+microplate-based+assays.">Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).</li><li>Beebe, D. P., Aronson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fibrinolytic+assay+performed+in+microtiter+plates.">An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates.</a> Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).</li><li>Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+platelet+aggregation+with+microplate+reader.+A+new+technical+approach+to+platelet+aggregation+studies.">Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies.</a> Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).</li><li>Pratt, C. W., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+coagulation+assays.">Microplate coagulation assays.</a> Biotechniques. 13, 430-433 (1992).</li><li>Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microplate+coagulation+assay+for+Factor+V+in+human+plasma.">Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma.</a> Thromb. J. 9, 11-16 (2011).</li><li>Toh, C. H., Downey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+Testing+in+disseminated+intravascular+coagulation.">Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation.</a> Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).</li><li>Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation:+Findings+in+346+patients.">Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients.</a> Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).</li><li>Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunoassay+of+factor+V+in+human+plasma+and+platelets.">Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets.</a> Blood. 60, 59-63 (1982).</li><li>Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+prothrombinase+complex.">Assembly of prothrombinase complex.</a> Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).</li><li>Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+TAFI,+a+thrombin-activable+fibrinolysis+inhibitor.">Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor.</a> J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).</li><li>Mammen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation+(DIC).">Disseminated intravascular coagulation (DIC).</a> Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).</li><li>Dahlb&#228;ck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+thrombophilia+due+to+a+previously+unrecognized+mechanism+characterized+by+poor+anticoagulant+response+to+activated+protein+C:+prediction+of+a+cofactor+to+activated+protein+C.">Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C.</a> PNAS. 90, 1004-108 (1993).</li><li>Dahlb&#228;ck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+pathogenic+mechanisms+of+thrombophilic+disorders.">Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders.</a> Blood. 112, 19-27 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الفحص الحركي طريقة صفيحة ميكروسكوبية الخطوط العريضة لتطوير الرواية، تقنية سريعة وغير مكلفة، وسهلة لقياس النشاط تخثر FV في عينات من البلازما البشرية التي لم (1-FV مرحلة الفحص) أو تم تفعيلها عمدا مع الثرومبين المضافة (FV 2 المرحلة، مقايسة). الفحص يستخدم قارئ صفيحة ميكروسكوبية الحركية وجميع المواد والكواشف المطلوبة متوفرة تجاريا أو قد تكون في المنزل. الفحص مستمر برصد التغير في ضوء مبعثر البلازما خلال تشكيل جلطة الليفين في 405nm. الفحص صفيحة ميكروسكوبية لديه ميزة استخدام كميات صغيرة عينة البلازما (ميكرولتر)، وهي قابلة للتحليل عينات متعددة في نفس الوقت (حتى 12). هذه الصفات هي مفيدة الفحص عند استخدام معدات غالية الثمن والكواشف (تحليل الآلي والبلازما التي تعاني من نقص عامل)؛ أحجام عينة صغيرة فقط هي المتاحة (البلازما المريض) أو تحليل عدد كبير من العينات (خلال تنقية و FVROM البلازما). الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV والمزايا أضاف أنه لأمر مريح، سريع، و لا يتطلب عزلة وتنقية المكونات التأسيسية المطلوبة. مقارنة مع دليل أنبوب الخيمة 3 و 4 و 5-7 المقايسات FV الآلي التي تم الإبلاغ عنها، وفحص صفيحة ميكروسكوبية FV لديه مجموعة مماثلة من المفيد مرات تجلط (25-75 ثانية) وما يقابلها من مستويات FV في العينة (0،5-0،005 وحدات / مل)، والحساسية / كشف حدود (20 80pM). مقارنة مع دليل المقايسات FV الخيمة أنبوب التي تعاني من تقييم مرئي شخصي لتشكيل جلطة 3 و 4 و الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV يسمح القياس الموضوعي والكمي للمرة الجلطة، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة الليفين. مقارنة مع المقايسات FV الآلي التي تعاني من شرط تحليل تكلفة والكواشف 5-7 و الفحص صفيحة ميكروسكوبية الكواشف والمواد FV غير مكلفة وجميع المواد المطلوبة قد تكون purchaالحوار الاقتصادي الاستراتيجي تجاريا أو المصنوعة في المنزل. دليل الخيمة أنبوب 3 و 4 و 5-7 المقايسات FV الآلي عموما لا توفر سوى الوقت لتشكيل جلطة؛ يست المرة، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة الليفين التي تقاس بدقة جميع طيفيا مع مقايسة صفيحة ميكروسكوبية FV. وأخيرا، دليل الخيمة أنبوب 3،4 الآلي و5-7 المقايسات FV تعاني من عدم فقط قادرة على قياس النشاط في عينات البلازما FV في وقت واحد، أما عن الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV هو قابل للارتفاع الإنتاجية و 12 عينات قد تكون يعاير في وقت واحد. تم استخدام صفيحة ميكروسكوبية الفحص لإثبات أن FV في 9 البلازما المريض DIC كان أقل نشاطا مما كانت عليه في NHP بسبب مزيج من المرات تأخر تجلط وانخفاض معدلات الأولية لتشكيل جلطة في فحص المرحلة 1-FV. لم يتم تغيير معدلات الأولية لتشكيل جلطة في فحص المرحلة 2-FV في البلازما المريض من مدينة دبي للإنترنت NHP. نطاقات من تشكيل جلطة في patien DICوأيضا ر البلازما لم يتغير من NHP في المرحلة FV 1-2-والمقايسات المرحلة. انخفض FV ربما كانت المرحلة 1، 2 المرحلة، ومجموع الأنشطة بسبب الاستهلاك المتزايد FV 19 و / أو تعطيل 6 وفقا دراسات أخرى خلال التسبب في هذا الاضطراب الدم المكتسبة. نظرا لمدى تشكيل جلطة في البلازما DIC هو نفسه كما لوحظ مع NHP، وكان هذا المتغير على الأرجح نتيجة للتركيز الفيبرينوجين في البلازما FV التي تعاني من نقص ولا علاقة لها خصائص البلازما المريض. وأشارت النتائج من فحص صفيحة ميكروسكوبية التي يمكن الحصول عليها من قياس النشاط FV في عينات من البلازما البشرية من قيم الوقت والأولي من تكوين الجلطة من الفحص 1-FV مرحلة ووقت تكوين الجلطة والنشاط الكلي من FV 2 - مرحلة الفحص. لم يكن من الممكن الحصول على القياس الكمي للنشاط FV في عينة البلازما يعتمد على مدى تشكيل جلطة في رانه FV 1 - 2-المقايسات والمرحلة الأولي أو معدل تكوين جلطة في FV 2-مرحلة الفحص. وبالنظر إلى كل ردود الفعل وصلت تقريبا بنفس الدرجة من تشكيل جلطة من 0،35 حتي 0،45 الوحدات بين الامتصاصية الأولي قبل وبعد الامتصاص القصوى تجلط الدم والكالسيوم بالإضافة إلى ذلك كلوريد، وقياس مدى تشكيل جلطة لا يوفر التقييم الكمي للنشاط في FV نظرا عينة البلازما. سوف تجد رواية فحص صفيحة ميكروسكوبية استخدامها في البحوث والمرافق الصحية لقياس النشاط FV في عينات من البلازما البشرية والكسور خلال تنقية لها من البلازما البشرية والحيوانية. ويمكن استخدام الفحص صفيحة ميكروسكوبية لقياس الوقت، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة؛ المعلمات لم ترصد عموما في وقت واحد في المقايسات الخيمة أنبوب دليل وتحليل التخثر الآلي. هذه المعلومات توفر أكثر من تقييم كمي كامل للمشاركة خلال الحدث FV تشكيل جلطةفي البلازما البشرية قد ذكر سابقا من 3-7. هذه المعلومات مهم بشكل خاص في كل من البحوث والمختبرات السريرية عند قياس تغيرات هامة في النشاط FV في عينات من البلازما أو مع تنقية FV أو فعفا. ويمكن أيضا الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV تستخدم لوصف وقياس المركبات التي قد تنشيط أو تعطيل FV وفعفا، وقياس النشاط FV في المرضى المعرضين لخطر الخثار الوريدي نتيجة لطفرة لايدن FV 20 و 21 و رصد نشاط FV خلال تنقية لها من البلازما. الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV قابل للتكيف بسهولة لقياس نشاط أي عامل التخثر في مسار، خارجي الجوهرية، أو مشتركة باستخدام عامل المناسبة التي تعاني من نقص البلازما والشروع في تشكيل لالكواشف الليفين. فإن مقايسة زيادة فهمنا للكيمياء الحيوية من خلال قياس FV أكثر من دقيقة وكاملة نشاطها في مجال البحوث والمختبرات السريرية. نهائيلاي، سوف تؤثر بشكل إيجابي على هذه المعلومات من خلال بيئات الرعاية الصحية التشخيص المبكر وتطوير علاجات أكثر فعالية للأفراد المصابين باضطرابات تخثر، مثل مدينة دبي للإنترنت.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> صفيحة ميكروسكوبية القارئ الحركية </td><td> الجزيئية الأجهزة </td><td> أطياف ماكس 190 </td><td> SOFTmax PRO برنامج LS 4،3 </td></tr><tr><td> تجميع البلازما العادي المرجعية الإنسان </td><td> الدقة الحيوية </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> صوديوم سترات </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV التي تعاني من نقص البلازما الإنسان 4 </td><td></td><td></td><td> مصنوعة من البلازما البشرية الطازجة وتخزينها في -70 درجة مأخوذة في C. </td></tr><tr><td> 3 و 60مل المحاقن </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 309585 136898 و </td><td></td></tr><tr><td> فراشة الجهاز </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> 20 مقياس </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيغما / الدريتش </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> الصياد </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> ثرومبوبلاستين </td><td> الثالوث في مجال التكنولوجيا الحيوية </td><td> T1106 </td><td> مدال مقابل HBS، ودرجة الحموضة 7.4 تخزينها في -70 درجة مأخوذة في C. </td></tr><tr><td> كلوريد الكالسيوم </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان ثرومبين 15 </td><td></td><td></td><td> من البلازما البشرية؛ تخزينها في -20 درجة مئوية في 50٪ (V / V) الجلسرين. </td></tr><tr><td> غشاء الديال </td><td> الصياد </td><td> 21-152-6 </td><td> 6 قطع 8kDa الوزن الجزيئي؛ 50mm خ 3M. </td></tr><tr><td> حامل قالب والقابلة للإزالة 8 شرائط أيضا. </td><td> نونك </td><td> و14-245-63 469957 </td><td></td></tr><tr><td> الصواني ELISA غسل </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 مل أنابيب microfuge و 15 مل المسمار توج. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690 62554205 و </td><td></td></tr><tr><td> ماصة الأقنية </td><td> الصياد </td><td> 2703630 </td><td> 8 قنوات نموذج. </td></tr></tbody></table>

measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay

ردا على إصابة، يتم تنشيط تجلط الدم ويؤدي إلى جيل من تخثر الأنزيم البروتيني، ثرومبين. ثرومبين يشق الفيبرينوجين إلى الليفين الذي يشكل الجلطة التي توقف النزف غير قابلة للذوبان. عامل V (FV) في شكله المنشط، فعفا، هو عامل مساعد حاسم لXa النشط البروتيني والتسريع من خلال تشكيل جيل ثرومبين جلطة الليفين كجزء من بروثرومبيناز 1 و 2. وقد وصف دليل المقايسات FV 3، 4، لكنها تستغرق وقتا طويلا والذاتية. تم الإبلاغ عن المقايسات الآلي FV 5-7 و لكن المحلل والكواشف غالية الثمن وعادة ما توفر فقط في المرة الجلطة، وليس معدل ومدى تشكيل الليفين. ويفضل النظام الأساسي لقياس انزيم صفيحة ميكروسكوبية المحفزة الأحداث بسبب الراحة، والوقت والتكلفة والحجم الصغير، والرصد المستمر، والإنتاجية العالية 8 و 9. تم الإبلاغ عن المقايسات صفيحة ميكروسكوبية للتحلل الجلطة 10، تراكم الصفائح الدموية11، و 12 عوامل التخثر، ولكن ليس لFV النشاط في البلازما البشرية. وكان الهدف من طريقة لوضع مقايسة صفيحة ميكروسكوبية الذي يقيس النشاط خلال تشكيل FV الليفين في البلازما البشرية. هذا الأسلوب صفيحة ميكروسكوبية الخطوط العريضة لرواية مقايسة بسيطة وغير مكلفة، والسريع للنشاط FV في البلازما البشرية. الفحص يستخدم قارئ صفيحة ميكروسكوبية الحركية لرصد التغير في الامتصاصية 405nm خلال تشكيل الليفين في البلازما البشرية (الشكل 1) 13. يقيس الفحص بدقة الوقت، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة الليفين. أنها تتطلب سوى كميات ميكرولتر من البلازما، واكتمال في 6 دقائق، يحتوي على نسبة عالية الإنتاجية، حساسة إلى 24 80pM FV، ويقيس كمية غير قصد تنشيط (1-مرحلة النشاط) وثرومبين تنشيط FV (النشاط 2-مرحلة ) للحصول على تقييم كامل من نشاطها وظيفية مجموع (2-مرحلة النشاط - 1-مرحلة النشاط). نشر intravascular التخثر (DIC) هو كغلوبثي المكتسبة التي غالبا ما يطور من العدوى موجودة من قبل 14. ويرتبط مع مدينة دبي للإنترنت بسوء التشخيص ومعدل وفيات أعلى من الزيادات علم الأمراض الموجودة سابقا 15. تم استخدام الفحص تبين أن المرضى الذين يعانون من في 9 مدينة دبي للإنترنت، وFV 1-المرحلة، المرحلة 2، ومجموع الأنشطة وانخفضت، في المتوسط، بنسبة 54٪، 44٪، و 42٪ على التوالي، مقارنة مع الإنسان العادي المجمعة إشارة البلازما (NHP). الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV قابل للتكيف بسهولة لقياس نشاط أي عامل التخثر. وهذا الفحص زيادة فهمنا للكيمياء الحيوية من خلال FV قياس أكثر من دقيقة وكاملة نشاطها في مجال البحث والمرافق الصحية. هذه المعلومات سوف تؤثر بشكل إيجابي على بيئات الرعاية الصحية من خلال التشخيص المبكر وتطوير علاجات أكثر فعالية لاضطرابات التخثر، مثل مدينة دبي للإنترنت.

ممثل النتائج - اعداد FV 1-مرحلة الفحص تخثر منحنيات معيار النشاط صفيحة ميكروسكوبية ويتضح من الأمثلة ممثل تشكيل جلطة الليفين في مقايسة مع مرور الوقت FV التي تم إنشاؤها بواسطة قارئ صفيحة ميكروسكوبية في الشكل 1. الفحص يقيس بدقة FV الوقت، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة الليفين. التفتيش على الآبار بعد استكمال الفحص أكد أن تشكيل جلطة حدث. وصلت جميع ردود الفعل بنفس الدرجة تقريبا من تشكيل جلطة مع تغيير عام في الامتصاصية في 405nm من 0،35 حتي 0،45 الوحدات بين الامتصاصية بدأت قبل وبعد الامتصاص القصوى تجلط الدم والكالسيوم بالإضافة إلى ذلك كلوريد. أمثلة ممثل FV منحنيات النشاط 1-مستوى المرحلة من الزمن كلوت دخول (في ثانية) مقابل نشاط FV دخول (وحدة / مل) و تسجيل قيم الأولي لتشكيل الجلطة (في mUnits / دقيقة) في مقابل نشاط FV دخول (وحدة / مل ويرد) لالتخفيفات المسلسل من NHP في <stronز&gt; الشكل 2A و 2B الشكل، على التوالي. تركيب مؤامرة دخول سجل الزمن، كلوت مقابل FV أشارت 1-نشاط علاقة قوية بين هذه المتغيرات بعد تحليل الانحدار الخطي (2A الشكل؛ R 2 = 0.980). تركيب مؤامرة دخول دخول لل-قيم الأولي لتشكيل الجلطة مقابل نشاط FV أشار أيضا إلى وجود علاقة قوية بين هذه المتغيرات بعد تحليل الانحدار الخطي (الشكل 2B، R 2 = 0.983). ظلت العلاقة بين كل من سجل الزمن كلوت و تسجيل قيم الأولي لتشكيل الجلطة مقابل سجل النشاط FV الخطية لNHP مخففة تصل إلى أضعاف-512. منذ FV يدور في NHP في الساعه 12-40nM 16، صفيحة ميكروسكوبية الفحص حساس لحوالي 24 80pM FV في NHP. بالنظر إلى أن التفكك المستمر للتفاعل دهون، فعفا-FXA في بروثرومبيناز حوالي 1nM 17، الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV هو مناسبة تماما لقياس مستويات FV في الناحية الفسيولوجية وrelevanر مجموعة نانومتر من أجل وظيفة في فعفا بروثرومبيناز. باستخدام مقايسة صفيحة ميكروسكوبية FV، تقرر أيضا أن المعدل الطبيعي للنشاط في نشاط FV FV مقايسة 1-مرحلة البلازما من 15 مراقبة صحية (ذكر وأنثى، العمر 18-من 20yrs) كان (يعني ± الانحراف المعياري؛ المدى): 0،96 ± 0.14U/ml؛ 0.68-1.11U/ml. هذا يتفق تماما مع النشاط FV صحية طبيعية ومجموعة (0.66-1.14U/ml) التي أبلغت عنها كاتلر وآخرون. لFV 1-مرحلة النشاط تحدد مع محلل الآلي 7. كان التباين داخل الفحص لمدى والوقت ومعدل الأولي لتشكيل جلطة في فحص المرحلة 1-FV في 6 آبار في 8 أيام مختلفة 3.4٪، 4.4٪، و 3.1٪، على التوالي. كان التباين بين الفحص لمدى والوقت ومعدل الأولي لتشكيل جلطة في فحص المرحلة 1-FV في 6 آبار من 8 تجارب مختلفة في 8 أيام مختلفة 7.1٪، 7.8٪، و 9.2٪، على التوالي. وهكذا، فإن التباين داخل وفيما بين هذه مقايسة-3 measuوكان الأحمر المتغيرات على مستوى منخفض ومقبول للحصول على أداء قوي الفحص داخل وبين صفيحة ميكروسكوبية فحص عينات متعددة في نفس الوقت (حتى 12). ممثل النتائج - يعاير عينات البلازما البشرية مع FV 1-2-مرحلة ومرحلة الفحص تخثر صفيحة ميكروسكوبية تم استخدام منحنى مستوى نشاط دخول كلوت مقابل الزمن FV دخول (الشكل 2A) لقياس النشاط في NHP FV و 9 البلازما المريض DIC التي لم يتم تنشيط عمدا مع الثرومبين المضافة (FV 1-مرحلة النشاط) أو تم تنشيط عمدا مع وأضاف الثرومبين (2-FV مرحلة النشاط) وتظهر النتائج في الجدول 1. عرض جميع 9 البلازما المريض DIC 1-FV المرحلة الأنشطة والمعدلات الأولية لتشكيل الجلطة التي انخفضت في المتوسط، بنسبة 54٪ و 18٪، على التوالي، من NHP. كانت بدرجات من تشكيل جلطة في فحص المرحلة 1-FV في المرضى DIC لا تختلف إلى حد كبير من NHP، وزيادة في المتوسط، بنسبة 13٪ من NHP. <html> ولدت تفعيل NHP مع الثرومبين تقريبي 8-أضعاف الزيادة في FV 2-مرحلة النشاط فوق النشاط 1-FV المرحلة (الجدول 1). هذا يشير إلى أن FV في NHP كان حاضرا بشكل رئيسي في شكله unactivated وتتفق مع النتائج المعلنة سابقا باستخدام دليل الخيمة أنبوب المقايسات FV 3 و 4 و المقايسات الآلي FV 5-7. وانخفضت أيضا 2-FV المرحلة والنشاط مجموع المرضى في مدينة دبي للإنترنت في المتوسط، بنسبة 44٪ و 42٪، على التوالي، من NHP. كانت المعدلات الأولية وبدرجات من تشكيل جلطة في FV 2-مرحلة الفحص في المرضى DIC لا يختلف كثيرا عن NHP، واختلفت في المتوسط، من٪ 9 تقريبا و 4٪ على التوالي، من تلك التي لوحظت مع NHP. وأشارت هذه النتائج أنه بالمقارنة مع FV في NHP، وFV في البلازما المريض DIC أدى في وقت لفترات طويلة وانخفاض معدل تكوين جلطة الليفين وأن المريض كان FV في المتوسط، 56٪ فقط كما activatable مع الثرومبين أيضا. الأنف والحنجرة &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تشكيل الجلطة العادية في تجميع البلازما قياس مرجعية الإنسان مع FV صفيحة ميكروسكوبية الحركية 1-مرحلة الفحص التخثر. تم رصد مستمر الليفين تشكيل جلطة في NHP في 405nm باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية الحركية. المؤامرة هو الناتج قارئ صفيحة ميكروسكوبية من رد فعل 6 دقائق من 32 أضعاف NHP الواحد، FV التي تعاني من نقص البلازما، تجلط الدم و كلوريد الكالسيوم في صفيحة ميكروسكوبية أيضا. ويمثل المحور الرأسي التغير في الامتصاصية في 405nm التي وقعت نتيجة لتشكيل الليفين في البلازما. تم تعريف وقت تكوين الفيبرين حيث أن الوقت للوصول إلى الزيادة القصوى في 1/2 الامتصاصية أو منتصف المنحنى (36.40 ثانية). تم تعريف معدل الأولي لتشكيل الجلطة، حيث وصل سعر تغيير الامتصاصية في 405nm على نقطة لأول مرة 5 من زيادة خطية من جزء من منحنى الامتصاص (611.88 mUnits / دقيقة). السابقينتم تعريف خيمة تشكيل الجلطة على أنها الفرق بين الامتصاصية القصوى والدنيا في 405 نانومتر (0.35 وحدة). <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. المنحنيات القياسية من الوقت ومعدل الأولي لتشكيل جلطة مقابل عامل النشاط العادي V في تجميع البلازما مرجع الإنسان باستخدام FV 1-مرحلة الفحص صفيحة ميكروسكوبية. تم تخفيفه بشكل متسلسل NHP (0 - لأضعاف-512 في HBS) ويعاير مع FV 1-مرحلة الفحص صفيحة ميكروسكوبية كما هو موضح في البروتوكول. وترد سجل دخول المؤامرات-من الوقت ومعدل الأولي لتشكيل جلطة مقابل النشاط FV FV في مرحلة الفحص 1-صفيحة ميكروسكوبية بعد النمذجة الانحدار الخطي للبيانات في لوحات A و B على التوالي. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عينة </td><td> 1-مرحلة نشاط الفحص (وحدة / مل) </td><td> 1-مرحلة الفحص مدى (وحدات) </td><tد&gt; 1-مرحلة الفحص الأولي قيم (mUnits / دقيقة) </td><td> 2-مرحلة نشاط الفحص (وحدة / مل) </td><td> 2-مرحلة الفحص مدى (وحدات) </td><td> 2-مرحلة الفحص الأولي قيم (mUnits / دقيقة) </td><td> حجم النشاط (وحدة / مل) </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1.02 </td><td> 0،363 </td><td> 744.96 </td><td> 7.93 </td><td> 0،433 </td><td> 375.84 </td><td> 6.91 </td></tr><tr><td> مريض 1 </td><td> 0.36 </td><td> 0،404 </td><td> 583.80 </td><td> 3.84 </td><td> 0،432 </td><td> 249.96 </td><td> 3.48 </td></tr><tr><td> المريض 2 </td><td> 0.67 </td><td> 0،416 </td><td> 704.04 </td><td> 5.28 </td><td> 0،469 </td><td> 323.16 </td><td> 4.61 </td></tr><tr><td><strong&gt; المريض 3 </td><td> 0.31 </td><td> 0،435 </td><td> 562.08 </td><td> 3.92 </td><td> 0،453 </td><td> 294.96 </td><td> 3.61 </td></tr><tr><td> مريض 4 </td><td> 0.39 </td><td> 0،435 </td><td> 617.04 </td><td> 4.14 </td><td> 0،462 </td><td> 372.60 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> 5 المريض </td><td> 0.73 </td><td> 0،401 </td><td> 641.40 </td><td> 5.91 </td><td> 0،433 </td><td> 354.24 </td><td> 5.18 </td></tr><tr><td> المريض 6 </td><td> 0.45 </td><td> 0،403 </td><td> 600.72 </td><td> 4.16 </td><td> 0،445 </td><td> 393.96 </td><td> 3.71 </td></tr><tr><td> 7 المريض </td><td> 0.49 </td><td> 0،395 </td><td> 575.40 </td><td> 4.89 </td><td> 0،449 </td><td> 357.48 </td><td> 4.40 </td></tr><tr><td> المريض 8 </td><td> 0.19 </td><td> 0،448 </td><td> 489.00 </td><td> 2.89 </td><td> 0،450 </td><td> 330.48 </td><td> 2.70 </td></tr><tr><td> المريض 9 </td><td> 0.64 </td><td> 0،423 </td><td> 699.48 </td><td> 5.11 </td><td> 0،455 </td><td> 417.24 </td><td> 4.47 </td></tr></tbody></table> تم تحديد الجدول 1 في نشاط FV NHP والمرضى في 9 التي وضعت المنتشر داخل الأوعية الدموية التخثر (DIC). وFV 1-المرحلة، المرحلة 2، ومجموع النشاط في NHP و 9 البلازما المريض من مدينة دبي للإنترنت 1-FV المرحلة صفيحة ميكروسكوبية معيار فحص يتم إعطاء منحنى وقت تكوين جلطة مقابل النشاط FV (الشكل 2A) وحدة / مل. معدلات الأولي (معدل الأولية للزيادة في A405nm على أول نقطة في غضون خمس mUnits / دقيقة) وبدرجات (الحد الأقصى A405nm - A40 الحد الأدنىوتبين ايضا و2-مرحلة الفحص صفيحة ميكروسكوبية - 5nm) من تشكيل جلطة في FV 1.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay at JoVE.com

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

هذه الدراسة توضح فحص صفيحة ميكروسكوبية الرواية التي تقيس النشاط FV تخثر تجلط الليفين خلال تشكيل في البلازما البشرية التي لم يبلغ عنها سابقا. أسلوب يستخدم قارئ صفيحة ميكروسكوبية الحركية باستمرار لقياس التغير في الامتصاصية في 405nm خلال تشكيل جلطة الليفين في البلازما البشرية.

قياس نشاط V عامل في البلازما البشرية باستخدام الفحص التخثر صفيحة ميكروسكوبية

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

فلوري<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين على الكروموسومات الميتوزى من البعوض

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

طريقة بسيطة وفعالة لكشف النووية في تفعيل عامل العدلات الإنسان من قياس التدفق الخلوي

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

والفحص صفيحة ميكروسكوبية لتقييم تأثيرات المواد الكيماوية على RBL-2H3 الصاري تحبب الخلايا: آثار التريكلوسان بدون استخدام مذيب عضوي

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

تفعيل وقياس NLRP3 Inflammasome آخر عن طريق IL-1β في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الإنسان

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

طريقة سريعة لمعالجة الدم إلى زيادة الغلة من مستويات البلازما الببتيد في الدم البشري

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

قياس ل<em&gt; في المختبر</em&gt; التكامل آخر من HIV-1 Preintegration مجمعات

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...