Name: measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay
Uploaded: 2012-09-09T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay at JoVE.com

המחקר נתמך בפיתוח מקצועי וקרני מחקר אתחול מאוניברסיטת אונטריו המכון טכנולוגי (UOIT) לד&quot;ר ג&#39;ון א Samis ומכון קנדי ​​לפרס בריאות מחקר בריאות מקצועית לתלמיד מחקר של אירינה לויט. המחברים מודים שינון אוורט (הוראה ומרכז למידה, UOIT) על סיועה בהכנת הסרטון. המחברים מודים ד&quot;ר מייקל א &#39;Nesheim (מחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת קווינס, קינגסטון, ON) לחונכותיו, תובנה ודיונים מועילים. המחברים גם להודות ד&quot;ר צ&#39;נג למשכן טווה (Haemostasis רואלד דאל ומרכז פקק, רויאל ליברפול חולים האוניברסיטאי, ליברפול, אנגליה) למתן פלזמות מטופל DIC השתמש במחקר.

<ol>
	<li>Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factor+V+activation+paradox.">The factor V activation paradox.</a> J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).</li><li>Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+factor+Va+into+prothrombinase+is+required+for+coordinated+cleavage+of+prothrombin+by+factor+Xa.">Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa.</a> J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).</li><li>Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V.">Factor V.</a> Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).</li><li>Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+preparation+of+factor+V+deficient+plasma.">A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma.</a> Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V+cleavage+and+inactivation+are+temporally+associated+with+elevated+elastase+during+experimental+sepsis.">Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis.</a> J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+factors+associated+with+neutrophil+elastase+and+coagulation+in+intensive+care+patients+with+a+biphasic+waveform+and+disseminated+intravascular+coagulation.">Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).</li><li>Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+11+novel+mutations+in+patients+with+heterozygous+and+homozygous+FV+deficiency.">Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency.</a> Haemophilia. 16, 937-942 (2010).</li><li>Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-sandwich+enzyme+immunoassay+for+one-step+noncompetitive+detection+of+corticosteroid+11-deoxycortisol.">Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol.</a> Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).</li><li>Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+key+metabolic+enzyme+activities+in+mammalian+cells+using+rapid+and+sensitive+microplate-based+assays.">Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).</li><li>Beebe, D. P., Aronson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fibrinolytic+assay+performed+in+microtiter+plates.">An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates.</a> Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).</li><li>Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+platelet+aggregation+with+microplate+reader.+A+new+technical+approach+to+platelet+aggregation+studies.">Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies.</a> Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).</li><li>Pratt, C. W., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+coagulation+assays.">Microplate coagulation assays.</a> Biotechniques. 13, 430-433 (1992).</li><li>Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microplate+coagulation+assay+for+Factor+V+in+human+plasma.">Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma.</a> Thromb. J. 9, 11-16 (2011).</li><li>Toh, C. H., Downey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+Testing+in+disseminated+intravascular+coagulation.">Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation.</a> Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).</li><li>Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation:+Findings+in+346+patients.">Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients.</a> Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).</li><li>Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunoassay+of+factor+V+in+human+plasma+and+platelets.">Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets.</a> Blood. 60, 59-63 (1982).</li><li>Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+prothrombinase+complex.">Assembly of prothrombinase complex.</a> Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).</li><li>Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+TAFI,+a+thrombin-activable+fibrinolysis+inhibitor.">Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor.</a> J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).</li><li>Mammen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation+(DIC).">Disseminated intravascular coagulation (DIC).</a> Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).</li><li>Dahlb&#228;ck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+thrombophilia+due+to+a+previously+unrecognized+mechanism+characterized+by+poor+anticoagulant+response+to+activated+protein+C:+prediction+of+a+cofactor+to+activated+protein+C.">Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C.</a> PNAS. 90, 1004-108 (1993).</li><li>Dahlb&#228;ck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+pathogenic+mechanisms+of+thrombophilic+disorders.">Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders.</a> Blood. 112, 19-27 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטת בדיקת microplate הקינטית מתארת ​​את התפתחות רומן, טכניקה מהירה, זולה, ונוחה למדידת פעילות קרישת FV בדגימות של פלזמה אנושית אשר לא (1-assay שלב ע&quot;ע) או שהופעל במכוון במוסף תרומבין (ע&quot;ע 2-שלב בדיקה). Assay מנצל קורא microplate הקינטית ואת כל החומרים וריאגנטים נדרשים זמינים מסחרי או עשויים להיות בבית. בדיקת רציפות מנטרת את השינוי בפיזור האור של פלזמה במהלך היווצרות קריש פיברין ב405nm. Assay microplate יש את היתרון של שימוש בכרכי מדגם פלזמה קטנים (μl) והוא נוח לניתוח של דגימות מרובות בו זמנית (עד 12). תכונות אלו assay הן יתרון כאשר ציוד וריאגנטים יקרים משמשים (מנתחים אוטומטיים ופלזמות Factor-לקויות); רק בנפחי מדגם קטנים זמינים (פלזמות חולות) או לנתח מספר גדול של דגימות (f במהלך טיהור FVrom פלזמה). Assay microplate FV יש את היתרונות המוספים שהוא נוח, מהיר ואינו דורש בידוד והטיהור של רכיבים המרכיבים את הנדרשים. לעומת Tilt-צינור ידני 3, 4 ו מבחני FV 5-7 אוטומטיים שכבר דיווחו, assay microplate FV יש טווח דומה שימושי של פעמי קריש (25-75 שניות) ורמות FV מקבילים במדגם (0.5-0.005 יחידות / מ&quot;ל), ורגישות / גילוי מגבלות (20-80pM). בהשוואה למבחנים ידניים Tilt-tube ע.נ. הסובלים מהערכה חזותית הסובייקטיבי של היווצרות קריש דם 3, 4, assay microplate FV מאפשר מדידה אובייקטיבית וכמותית של זמן הקריש, שיעור ראשוני, ומידה של היווצרות קריש פיברין. בהשוואה למבחנים אוטומטיים ע.נ. הסובלים מהדרישה של מנתחים ומגיב יקרים 5-7 את ריאגנטים FV microplate assay וחומרים הם זולים ואת כל החומרים הדרושים עשויים להיות purchased מסחרי או שנעשה בבית. Tilt-צינור 3 ידניים, 4 ומבחני FV 5-7 אוטומטיים בדרך כלל רק לספק הזמן להיווצרות קריש דם, לא זמן, שיעור ראשוני, והמידה של היווצרות קריש הפיברין אשר כל למדוד במדויק spectrophotometrically עם assay microplate FV. לבסוף, מבחני FV 5-7 Tilt-צינור ידניים ואוטומטיים 3,4 סובלים מלהיות יחיד מסוגל למדוד את פעילות FV בדגימות פלזמה אחד בכל פעם, ואילו assay microplate FV הוא נוח לתפוקה גבוהה ו12 דגימות עשויות להיות assayed בו זמנית. Assay microplate שמש כדי להוכיח שע&quot;ע ב9 פלזמות מטופל DIC היה פחות פעיל מאשר בNHP בגלל שילוב של זמני קריש מתעכבים ושיעורים ראשוניים נמוכים יותר של היווצרות קריש דם בבדיקת ע.נ. 1-הבמה. השיעורים הראשונים של היווצרות קריש דם בבדיקת 2-שלב FV בפלזמות מטופל DIC לא השתנו מNHP. את גודל היווצרות קריש דם בדסק&quot;ש patienלא פלזמות גם לא שונו מNHP בע.נ. 1-הבמה ומבחנים 2-במה. ירידת ע.נ. 1-במה, 2 שלבים, וכלל פעילויות הייתה אולי כתוצאה מצריכה המוגברת FV 19 ו / או איון 6 בהתאם למחקרים אחרים בפתוגנזה של מחלת דם שנרכש זה. בהתחשב בהיקף היווצרות קריש דם בפלזמות DIC היה זהה נצפה עם NHP, משתנה זה היה ככל הנראה תוצאה של ריכוז פיברינוגן בפלזמת FV-הלקויה ואינה קשור למאפיינים של פלזמות המטופל. התוצאות של בדיקת microplate ציינו כי מדידה של פעילות FV בדגימות של פלזמה האנושית ניתן לקבל מהרגע ראשון וקצב היווצרות קריש מassay ע.נ. 1-השלב והזמן של היווצרות קריש דם ופעילות הכוללת מע.נ. 2 - assay במה. לא ניתן היה להשיג מדידת כמותית של פעילות FV בדגימת פלזמה המבוססת על המידה להיווצרות קרישים בtהוא 1 ע.נ. - ומבחנים 2-במה או השיעור הראשוני של היווצרות קריש דם בבדיקת 2-שלב FV. בהינתן כל התגובות הגיעו לאותה המידה של היווצרות קריש דם של 0.35 כ - 0.45 יחידות בין הספיגה הראשונית לפני ואחרי הספיגה המקסימלי thromboplastin ובנוסף סידן כלוריד, מדידה של היקף היווצרות קריש דם אינה מספקת הערכה כמותית של פעילות FV ב נתן דגימת פלזמה. Assay microplate הרומן ימצא שימוש במחקר ובמסגרות קליניות למדידה של פעילות FV בדגימות של פלזמה אנושית ושברים במהלך טיהורו מפלזמה אנושית ובעלי חיים. Assay microplate עשוי לשמש למדידת הזמן, שיעור ראשוני, והיקף של היווצרות קריש דם; פרמטרים לא נבדקו כלל במקביל במבחני Tilt-tube ומנתחי קרישה אוטומטיים ידניים. מידע זה מספק יותר מהערכה כמותית שלמה של המעורבות של FV במהלך אירוע היווצרות קריש הדםבפלזמה אנושית יותר ממה שדווח בעבר 3-7. מידע זה חשוב במיוחד במחקר והן במעבדות קליניות בעת מדידת שינויים משמעותיים בפעילות FV בדגימות של פלזמה או עם מטוהר FV או FVa. Assay microplate FV עשוי לשמש גם כדי לאפיין ולמדוד תרכובות שיכולים להפעיל או לנטרל FV וFVa, למדוד את פעילות FV בחולים בסיכון לפקקת ורידים כתוצאה ממוטצית ליידן FV 20, 21 וכדי לפקח על הפעילות של FV במהלך טיהורו מהפלזמה. Assay microplate FV הוא להתאמה בקלות למדוד את הפעילות של כל גורם קרישה במסלול החיצוני, הפנימי, או משותף באמצעות הפלזמה המתאימה גורם הלקויה וייזום ריאגנטים להיווצרות פיברין. Assay יגדיל את ההבנה של FV הביוכימיה שלנו באמצעות מדידה מדויקת ומלאה יותר של פעילותה במחקר ובמעבדות קליניות. סופיly, מידע זה יהיה השפעה חיובית סביבות בריאות באמצעות אבחון ופיתוח טיפולים יעילים יותר עבור אנשים הסובלים מהפרעות קרישה, כגון דסק&quot;ש קודם לכן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> קינטי microplate קורא </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> ספקטרה מקס 190 </td><td> 4.3 תוכנת SOFTmax PRO LS </td></tr><tr><td> פלזמת התייחסות רגילה נקוותה אנושית </td><td> דיוק ביולוגי </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> Trisodium ציטראט </td><td> הקיטון דיקנסון </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> הקיטון דיקנסון </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> פלזמה אנושית FV לקוי 4 </td><td></td><td></td><td> עשוי מפלזמה אנושית טריה ומאוחסן בaliquots ב -70 ° C. </td></tr><tr><td> 3 ו 60מזרקי מ&quot;ל </td><td> הקיטון דיקנסון </td><td> 309585 ו136898 </td><td></td></tr><tr><td> מנגנון פרפר </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> 20 מד </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> דיג </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Thromboplastin </td><td> טריניטי ביוטק </td><td> T1106 </td><td> דיאליזה לעומת HBS, pH 7.4 ומאוחסן בaliquots ב -70 ° C. </td></tr><tr><td> סידן כלוריד </td><td> הקיטון דיקנסון </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> 15 תרומבין אדם </td><td></td><td></td><td> מפלזמה אנושית; מאוחסן ב -20 ° C ב 50% (v / v) גליצרול. </td></tr><tr><td> קרום דיאליזה </td><td> דיג </td><td> 21-152-6 </td><td> 6-8kDa חיתוך משקל מולקולרי; 50mm x 3m. </td></tr><tr><td> בעל תבנית ונשלף 8 רצועות גם. </td><td> Nunc </td><td> 14-245-63 ו469957 </td><td></td></tr><tr><td> מגשי כביסת ELISA </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 microfuge מ&quot;ל ו 15 צינורות הכתירו בורג מ&quot;ל. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690 ו62554205 </td><td></td></tr><tr><td> פיפטה הרבה ערוצים </td><td> דיג </td><td> 2703630 </td><td> דגם 8 ערוצים. </td></tr></tbody></table>

measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay

בתגובה לפציעה, קרישת דם מופעלת ותוצאות בדור של פרוטאז הקרישה, טרומבין. פיברינוגן תרומבין דבק בפיברין אשר מהווה מסיס קריש שעוצר את הדימום. פקטור V (ע&quot;ע) בצורתו הפעילה, FVa, הוא קריטי לcofactor פרוטאז FXa והמאיץ של דור תרומבין במהלך היווצרות קריש הפיברין כחלק מ1 prothrombinase, 2. מבחני FV הידניים תוארו 3, 4, אבל הם גוזלים זמן וסובייקטיבי. מבחנים אוטומטיים FV דווחו 5-7, אך המנתח וריאגנטים יקרים ומספקים בדרך כלל רק זמן הקריש, לא שיעור וההיקף של היווצרות פיברין. פלטפורמת microplate עדיפה למדידת אירועי אנזימים catalyzed בגלל הנוחות, זמן, עלות, נפח קטן, ניטור רציף, ותפוקה גבוהה 8, 9. מבחני microplate דווחו לתמוגה קריש 10, טסיות דם11, וגורמי קרישה 12, אך לא עבור פעילות FV בפלזמה אנושית. מטרת השיטה הייתה לפתח assay microplate שמודד את פעילות FV במהלך היווצרות פיברין בפלזמה אנושית. שיטת microplate רומן זה מתארת ​​assay פשוט, זול ומהיר של פעילות FV בפלזמה אנושית. Assay מנצל קורא microplate הקינטית ללפקח שינוי בספיגת 405nm במהלך היווצרות פיברין בפלזמה אנושית (איור 1) 13. הבדיקה מדויקת מודדת את הזמן, שיעור ראשוני, ומידה של היווצרות קריש פיברין. זה דורש רק כמויות μl של פלזמה, הושלם ב6 דקות, יש תפוקה גבוהה, הוא רגיש ל24 80pM FV, ומודד את הכמות הופעל שלא במתכוון (פעילות 1-במה) ו( ע&quot;ע פעילות תרומבין הופעל-2-שלב ) כדי לקבל הערכה מלאה של הפעילות הפונקציונלית הכוללת שלה (פעילות 2-במה - פעילות 1-שלב). intravas הופץcular הקרישה (DIC) היא coagulopathy רכש כי לרוב מתפתח מזיהומים קיימים מראש 14. דסק&quot;ש קשור לפרוגנוזה גרועה ותמותת עליות מעל 15 פתולוגיה קיימת מראש. הבדיקה נעשתה שימוש כדי להראות כי ב9 חולים עם דסק&quot;ש, ע.נ. 1-הבמה, 2-במה, וכלל פעילויות שירד, בממוצע, ב 54%, 44%, ו 42%, בהתאמה, בהשוואה לאדם רגיל נקווה התייחסות הפלזמה (NHP). Assay microplate FV הוא להתאמה בקלות למדוד את הפעילות של כל גורם קרישה. assay זה יגביר את ההבנה של FV הביוכימיה שלנו באמצעות מדידה מדויקת ומלאה יותר של פעילותה במחקר ובמסגרות קליניות. מידע זה יהיה השפעה חיובית סביבות בריאות באמצעות אבחון ופיתוח טיפולים יעילים יותר להפרעות קרישה, כגון דסק&quot;ש קודם לכן.

נציג תוצאות - הכנת FV עקומות 1-במת microplate קרישת assay פעילות הרגילה דוגמה מייצגת להיווצרות קרישי הפיברין בassay FV לאורך זמן נוצר על ידי microplate הקורא מוצגת באיור 1. Assay FV במדויק מודד את הזמן, שיעור ראשוני, ומידה של היווצרות קריש פיברין. בדיקה של בארות עם השלמת בדיקה אשרה כי היווצרות קריש דם התרחשה. כל התגובות הגיעו בערך באותו ההיקף של היווצרות קריש דם עם שינוי כללי בספיגה ב405nm של 0.35-0.45 יחידות בין הספיגה מתחילה לפני ואחרי הספיגה המקסימלי thromboplastin ובנוסף סידן כלוריד. דוגמאות מייצגות של עקומות ע.נ. 1-שלב פעילות סטנדרטיות של זמן קריש התחבר (בשניות) לעומת פעילות התחבר FV (יחידות / מ&quot;ל) וכניסת דרג ראשוני של היווצרות קריש דם (בmUnits / min) פעילות לעומת התחבר FV (יחידות / מ&quot;ל ) לדילולים סידוריים של NHP מוצגת ב <stronז&gt; איור 2 א ו -2 איור, בהתאמה. התאמת העלילה התחבר התחבר של זמן קריש לעומת ע.נ. 1-פעילות הצביעה על קשר חזק בין המשתנים הללו לאחר ניתוח רגרסיה ליניארית (איור 2 א; R 2 = 0.980). התאמת העלילה התחבר התחברה מהדרג הראשוני של היווצרות קריש דם לעומת פעילות FV ציינה גם קשר חזק בין המשתנים הללו לאחר ניתוח רגרסיה ליניארית (התרשים 2B, R 2 = 0.983). מערכת היחסים של שניהם זמן הקריש התחבר והתחבר דרג ראשוני של היווצרות קריש דם לעומת פעילות FV התחבר נשארה ליניארי לNHP דילול עד 512-קיפול. מאז FV מסתובב בNHP בכ 12 40nm-16, assay microplate רגיש לכ 24 80pM FV בNHP. בהתחשב בכך שהניתוק המתמיד של האינטראקציה של FVa-FXa-שומנים בprothrombinase הוא כ 1nm 17, assay microplate FV הוא לגמרי מתאים למדידה של רמות FV בפיסיולוגי relevanמגוון nM לא לפונקצית FVa בprothrombinase. שימוש assay microplate FV, זה נקבע גם שהטווח הנורמלי של פעילות FV בassay ע.נ. 1-שלב הפעילות של 15 פלזמות בריאות שליטה (זכר ונקבה, גיל 18-20yrs) היה (ממוצע ± סטיית תקן, טווח): 0.96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. זה מסכים גם עם הפעילות הנורמלית הבריאות ומגוון FV (0.66-1.14U/ml) דווחה על ידי קטלר et al. לFV פעילות 1-שלב נקבעה עם מנתח אוטומטי 7. שונות התוך assay של הזמן, במידה והשיעור ראשוני של היווצרות קריש דם בבדיקת 1-שלב FV 6 בבארות על 8 ימים שונים היו 3.4%, 4.4%, ו -3.1%, בהתאמה. ההשתנות-assay בין של הזמן, במידה והשיעור ראשוני של היווצרות קריש דם בבדיקת 1-שלב FV 6 בבארות של 8 ניסויים שונים על 8 ימים שונים היו 7.1%, 7.8% ו -9.2%, בהתאמה. לפיכך, השתנות פן ו- assay בין השלוש אלה measuמשתנים אדומים היו ברמה נמוכה ומקובלת לביצוע בדיקה חזק בתוך ובין assay microplate של דגימות מרובות בו זמנית (עד 12). נציג תוצאות - assaying דגימות פלזמה אנושיות עם ע.נ. 1-השלב ובדיקת קרישת microplate 2-שלב עקומת הסטנדרט של פעילות מול התחבר קריש זמן התחבר FV (איור 2 א) שמשה למדידת פעילות FV בNHP ופלזמות מטופל 9 DIC שלא הופעלו במכוון במוסף תרומבין (פעילות 1-שלב ע&quot;ע) או במכוון הופעלו עם הוסיף תרומבין (פעילות 2-שלב ע&quot;ע) והתוצאות מוצגות בטבלת 1. כל 9 פלזמות מטופל DIC הציגו FV פעילויות 1-במה ושיעורים הראשונים של היווצרות קריש דם שירדו בממוצע ב 54% ו 18%, בהתאמה, מNHP. את גודל היווצרות קריש דם בבדיקת 1-שלב FV בחולי DIC לא היו במידה רבה שונים מNHP, ועלה בממוצע, ב 13% מNHP. <html> הפעלה של NHP עם תרומבין שנוצרה גידול 8-פי משוער בFV פעילות 2-שלב מעל פעילות 1-שלב FV (טבלה 1). זה מצביע על כך ע&quot;ע בNHP היה בעיקר בצורתו נוכחית לא הממושכת שלו ומסכים עם תוצאות שדווחו בעבר באמצעות מבחנים ידניים Tilt-tube FV 3, 4 מבחני FV אוטומטיים 5-7. FV 2-הבמה ומסך פעילותם הירד גם בחולי DIC בממוצע, 44% ו 42%, בהתאמה, מNHP. השיעורים הראשוניים וההיקפים של היווצרות קריש דם בבדיקת 2-במה בחולי DIC FV לא היו שונים משמעותי מNHP ומגוונים בממוצע, ב 9% וכ 4%, בהתאמה, מזו שנצפתה בNHP. תוצאות אלו מצביעות על כך שלעומת FV בNHP, FV בפלזמות מטופל DIC הביא זמן ממושך וירידה בקצב היווצרות קריש הפיברין וכי החולה FV היה בממוצע, רק 56% כactivatable עם תרומבין גם כן. אף אוזן הגרון &quot;fo: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. היווצרות קריש דם בפלזמה נורמלית נקוותה אדם התייחסות נמדדה עם microplate FV הקינטית assay קרישה 1-במה. היווצרות קריש פיברין בNHP הייתה פיקוח ברציפות ב405nm באמצעות קורא microplate קינטית. העלילה היא הפלט של קורא microplate תגובת 6 דקות של NHP 32-לקפל בדילול המלאה, פלזמה FV-לקויה, thromboplastin, וכלוריד הסידן בmicroplate היטב. הציר האנכי מייצג את השינוי בספיגה ב405nm שאירע כתוצאה מהיווצרות פיברין בפלזמה. הזמן של היווצרות הפיברין הוגדר כזמן להגיע לגידול המקסימאלי 1/2 בספיגה או האמצע עקום (36.40 שניות). השיעור הראשוני של היווצרות קריש דם הוגדר כשיעור שינוי של ספיגה ב405nm במהלך 5 נקודתי הזמן הראשונות של העלייה ליניארית של חלק הספיגה של העקומה (611.88 mUnits / min). לשעבראוהל של היווצרות קריש דם הוגדר כהבדל בין הספיגה המקסימלי ומינימאלית ב405 ננומטר (0.35 יחידות). <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. עקומות סטנדרטיות של זמן וקצב ראשוני של היווצרות קריש דם לעומת פעילות V פקטור בפלזמת התייחסות נורמלית נקוותה אנושית באמצעות FV assay microplate 1-במה. NHP הייתה מדוללת סדרתי (0 - ל 512-לקפל ברוורד) וassayed עם FV assay microplate 1-במה, כמתואר בפרוטוקול. חלקות יומן יומן של הזמן והקצב ראשוני של היווצרות קריש דם לעומת פעילות בע.נ. ע.נ. assay microplate 1-במה מוצגות לאחר דוגמנות רגרסיה לינארית של הנתונים בלוחות, ו-B בהתאמה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מדגם </td><td> פעילות assay 1-במה (יחידות / מ&quot;ל) </td><td> היקף assay 1-במה (יחידות) </td><tד&gt; assay 1-שלב דרג ראשוני (mUnits / דקות) </td><td> פעילות assay 2-במה (יחידות / מ&quot;ל) </td><td> היקף assay 2-במה (יחידות) </td><td> דרג ראשוני assay 2-במה (mUnits / דקות) </td><td> פעילות כוללת (יחידות / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1.02 </td><td> 0.363 </td><td> 744.96 </td><td> 7.93 </td><td> 0.433 </td><td> 375.84 </td><td> 6.91 </td></tr><tr><td> חולה 1 </td><td> 0.36 </td><td> 0.404 </td><td> 583.80 </td><td> 3.84 </td><td> 0.432 </td><td> 249.96 </td><td> 3.48 </td></tr><tr><td> חולה 2 </td><td> 0.67 </td><td> 0.416 </td><td> 704.04 </td><td> 5.28 </td><td> 0.469 </td><td> 323.16 </td><td> 4.61 </td></tr><tr><td><strong&gt; חולה 3 </td><td> 0.31 </td><td> 0.435 </td><td> 562.08 </td><td> 3.92 </td><td> 0.453 </td><td> 294.96 </td><td> 3.61 </td></tr><tr><td> מטופל 4 </td><td> 0.39 </td><td> 0.435 </td><td> 617.04 </td><td> 4.14 </td><td> 0.462 </td><td> 372.60 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> מטופל 5 </td><td> 0.73 </td><td> 0.401 </td><td> 641.40 </td><td> 5.91 </td><td> 0.433 </td><td> 354.24 </td><td> 5.18 </td></tr><tr><td> חולה 6 </td><td> 0.45 </td><td> 0.403 </td><td> 600.72 </td><td> 4.16 </td><td> 0.445 </td><td> 393.96 </td><td> 3.71 </td></tr><tr><td> חולה 7 </td><td> 0.49 </td><td> 0.395 </td><td> 575.40 </td><td> 4.89 </td><td> 0.449 </td><td> 357.48 </td><td> 4.40 </td></tr><tr><td> מטופל 8 </td><td> 0.19 </td><td> 0.448 </td><td> 489.00 </td><td> 2.89 </td><td> 0.450 </td><td> 330.48 </td><td> 2.70 </td></tr><tr><td> מטופל 9 </td><td> 0.64 </td><td> 0.423 </td><td> 699.48 </td><td> 5.11 </td><td> 0.455 </td><td> 417.24 </td><td> 4.47 </td></tr></tbody></table> פעילות טבלת 1 ע.נ. בNHP וב9 חולים שפתחו מופץ קרישת intravascular (DIC). ע.נ. 1-הבמה, 2-במה, ופעילות הכוללת בNHP ופלזמות מטופל 9 DIC נקבעה משלב 1-FV microplate assay הסטנדרטי עקומת זמן של היווצרות קריש דם לעומת פעילות FV (איור 2 א) וניתנת ביחידות / מ&quot;ל. השיעורים הראשונים (שיעור ראשוני של עלייה בA405nm מעל חמש נקודות בפעם הראשונה בmUnits / min) ומי פחות (A405nm המרבי - A40 מינימום5nm) להיווצרות קרישים ב1 ע.נ. - וassay microplate 2-במה מוצגים גם.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay at JoVE.com

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

מחקר זה מתאר assay microplate רומן שמודד את פעילות קרישת FV במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית שלא דווח בעבר. השיטה משתמשת בקורא microplate הקינטית ברציפות כדי למדוד את השינוי בספיגה ב405nm במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית.

מדידה של פעילות פקטור V בפלזמה אנושית באמצעות Assay קרישת Microplate

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

שיטה מהירה עבור עיבוד דם כדי להגדיל את התשואה של רמות הפפטיד פלזמה בדם אנושי

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...