Name: measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay
Uploaded: 2012-09-09T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
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अनुसंधान के ओंटारियो प्रौद्योगिकी संस्थान (UOIT) विश्वविद्यालय से व्यावसायिक विकास और अनुसंधान स्टार्टअप फंड डॉ. जॉन ए Samis और स्वास्थ्य अनुसंधान स्वास्थ्य पेशेवर छात्र अनुसंधान Irina Levit पुरस्कार के एक कनाडाई संस्थानों के साथ समर्थन किया था. लेखक उसे वीडियो तैयार करने में सहायता के लिए शान्नोन Everett (शिक्षण और लर्निंग सैंटर, UOIT) को स्वीकार करते हैं. लेखकों उसकी सदस्यता, अंतर्दृष्टि और उपयोगी विचार विमर्श के लिए डॉ. माइकल ई. Nesheim (जैव रसायन विभाग, रानी के विश्वविद्यालय, किंग्स्टन, पर) को स्वीकार करते हैं. लेखकों को भी डीआईसी रोगी अध्ययन में इस्तेमाल plasmas प्रदान करने के लिए डा. चेंग ओल (Roald Dahl Haemostasis और घनास्त्रता केन्द्र, रॉयल लिवरपूल विश्वविद्यालय अस्पताल, लिवरपूल, ब्रिटेन) तो स्वीकार करते हैं.

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	<li>Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factor+V+activation+paradox.">The factor V activation paradox.</a> J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).</li><li>Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+factor+Va+into+prothrombinase+is+required+for+coordinated+cleavage+of+prothrombin+by+factor+Xa.">Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa.</a> J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).</li><li>Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V.">Factor V.</a> Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).</li><li>Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+preparation+of+factor+V+deficient+plasma.">A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma.</a> Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V+cleavage+and+inactivation+are+temporally+associated+with+elevated+elastase+during+experimental+sepsis.">Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis.</a> J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+factors+associated+with+neutrophil+elastase+and+coagulation+in+intensive+care+patients+with+a+biphasic+waveform+and+disseminated+intravascular+coagulation.">Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).</li><li>Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+11+novel+mutations+in+patients+with+heterozygous+and+homozygous+FV+deficiency.">Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency.</a> Haemophilia. 16, 937-942 (2010).</li><li>Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-sandwich+enzyme+immunoassay+for+one-step+noncompetitive+detection+of+corticosteroid+11-deoxycortisol.">Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol.</a> Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).</li><li>Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+key+metabolic+enzyme+activities+in+mammalian+cells+using+rapid+and+sensitive+microplate-based+assays.">Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).</li><li>Beebe, D. P., Aronson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fibrinolytic+assay+performed+in+microtiter+plates.">An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates.</a> Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).</li><li>Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+platelet+aggregation+with+microplate+reader.+A+new+technical+approach+to+platelet+aggregation+studies.">Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies.</a> Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).</li><li>Pratt, C. W., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+coagulation+assays.">Microplate coagulation assays.</a> Biotechniques. 13, 430-433 (1992).</li><li>Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microplate+coagulation+assay+for+Factor+V+in+human+plasma.">Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma.</a> Thromb. J. 9, 11-16 (2011).</li><li>Toh, C. H., Downey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+Testing+in+disseminated+intravascular+coagulation.">Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation.</a> Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).</li><li>Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation:+Findings+in+346+patients.">Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients.</a> Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).</li><li>Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunoassay+of+factor+V+in+human+plasma+and+platelets.">Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets.</a> Blood. 60, 59-63 (1982).</li><li>Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+prothrombinase+complex.">Assembly of prothrombinase complex.</a> Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).</li><li>Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+TAFI,+a+thrombin-activable+fibrinolysis+inhibitor.">Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor.</a> J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).</li><li>Mammen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation+(DIC).">Disseminated intravascular coagulation (DIC).</a> Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).</li><li>Dahlb&#228;ck, B., Carlsson, M., Svensson, P. 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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

गतिज microplate परख विधि एक उपन्यास, मानव प्लाज्मा के नमूने जो (FV परख 1-चरण) या नहीं में FV जमावट गतिविधि की माप के लिए तेजी से, सस्ती और सुविधाजनक तकनीक के विकास की रूपरेखा जानबूझकर किया गया है साथ जोड़ा थ्रोम्बिन (FV सक्रिय दो चरण) परख. परख गतिज microplate पाठक का इस्तेमाल करता है और सभी सामग्री और अभिकर्मकों की आवश्यकता है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं या घर में किया जा सकता है. परख लगातार 405nm पर आतंच थक्का गठन के दौरान प्लाज्मा के प्रकाश तितर बितर में परिवर्तन पर नज़र रखता है. microplate परख छोटे प्लाज्मा नमूना संस्करणों (μl) का उपयोग करने का फायदा है और एक साथ एकाधिक नमूने (12) के विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है. ये परख विशेषताओं फायदेमंद हैं जब महंगे उपकरण और अभिकर्मकों (स्वचालित analyzers और फैक्टर कमी plasmas) का उपयोग किया जाता है, केवल छोटा सा नमूना मात्रा उपलब्ध हैं (रोगी plasmas) या FV शुद्धि च के दौरान नमूनों की एक बड़ी संख्या (विश्लेषणरॉम प्लाज्मा). FV microplate परख जोड़ा लाभ है कि यह सुविधाजनक है, तेज है, और अलगाव और आवश्यक घटक घटकों के शोधन की आवश्यकता नहीं है. पुस्तिका झुकाव ट्यूब 3, 4 और स्वचालित 5-7 FV assays कि सूचना दी गई है के साथ तुलना में, FV microplate परख थक्का बार की तुलना उपयोगी रेंज (25-75 सेकंड) और नमूना में इसी FV स्तर (.5-0.005 इकाइयों / एमएल), और / संवेदनशीलता का पता लगाने सीमा (20-80pM). पुस्तिका झुकाव ट्यूब FV assays जो थक्का गठन 3, 4 के एक व्यक्तिपरक दृश्य मूल्यांकन से पीड़ित के साथ तुलना में, FV microplate परख थक्का समय के उद्देश्य और मात्रात्मक माप, प्रारंभिक दर, और आतंच थक्का गठन की हद तक परमिट. स्वचालित FV assays जो महंगी analyzers और अभिकर्मकों 5-7 की आवश्यकता से पीड़ित के साथ तुलना में, FV microplate परख अभिकर्मकों और सामग्री सस्ती कर रहे हैं और सभी आवश्यक सामग्री purcha हो सकता हैव्यावसायिक तौर पर sed या घर में बनाया. मैनुअल झुकाव ट्यूब 3, 4 और स्वचालित 5-7 FV assays आमतौर पर केवल थक्का गठन के लिए समय प्रदान करते हैं, समय नहीं प्रारंभिक दर, और आतंच थक्का गठन है जो सभी सही FV microplate परख के साथ spectrophotometrically मापा की हद तक. अंत में, झुकाव ट्यूब मैनुअल 3,4 और स्वचालित 5-7 FV assays केवल प्लाज्मा नमूनों में एक समय में एक FV गतिविधि को मापने के लिए सक्षम किया जा रहा से पीड़ित हैं, जबकि FV microplate परख करने के लिए उत्तरदायी है और उच्च throughput 12 नमूने हो सकता है एक साथ assayed. microplate परख को दिखाना है कि 9 डीआईसी रोगी plasmas में FV कम NHP में देरी थक्का बार और FV परख एक चरण में थक्का गठन के कम शुरूआती दरों का एक संयोजन की वजह से सक्रिय था करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. डीआईसी रोगी plasmas में FV परख दो चरण में थक्का गठन की प्रारंभिक दरें NHP से नहीं बदला गया था. डीआईसी Patien में थक्का गठन का विस्तारटी plasmas भी 1 चरण FV और 2 चरण assays में NHP से बदल नहीं किया गया. FV कम एक चरण, 2 - मंच, और कुल गतिविधियों अन्य अध्ययन के साथ इस अधिग्रहीत रक्त विकार के रोगजनन दौरान अनुसार वृद्धि की FV खपत 19 और / या छह निष्क्रियता के कारण हो सकता है. डीआईसी plasmas में थक्का गठन की हद NHP के साथ मनाया के रूप में एक ही था को देखते हुए, इस चर FV की कमी प्लाज्मा में फाइब्रिनोजेन एकाग्रता का एक परिणाम होने की संभावना है और रोगी plasmas की विशेषताओं के लिए संबंधित नहीं था. microplate परख से परिणाम संकेत दिया है कि मानव प्लाज्मा के नमूने में FV गतिविधि के माप थक्का गठन के समय और प्रारंभिक दर FV परख एक चरण से और थक्का और दो FV से कुल गतिविधि गठन के समय से प्राप्त किया जा सकता है - मंच परख. यह संभव करने के लिए एक प्लाज्मा नमूने में टी में थक्का गठन की सीमा के आधार पर FV गतिविधि के मात्रात्मक माप प्राप्त नहीं था1 FV वह और 2 चरण assays या FV परख दो चरण में थक्का गठन के प्रारंभिक दर. सभी प्रतिक्रियाओं लगभग 0.35 का थक्का गठन के उसी हद तक पहुँच को देखते हुए पहले प्रारंभिक के absorbance और thromboplastin और कैल्शियम क्लोराइड इसके अलावा के बाद अधिक से अधिक absorbance के बीच 0.45 इकाइयों, थक्का गठन की हद तक की माप में एक FV गतिविधि के मात्रात्मक आकलन प्रदान नहीं करता है प्लाज्मा नमूना दिया. उपन्यास microplate परख FV गतिविधि के मानव और मानव और पशुओं के प्लाज्मा से शोधन के दौरान प्लाज्मा fractions के नमूने में माप के लिए अनुसंधान और नैदानिक ​​सेटिंग में उपयोग मिल जाएगा. microplate परख के लिए समय, प्रारंभिक दर और थक्का गठन की हद तक को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मानकों को एक साथ पुस्तिका झुकाव ट्यूब assays और स्वचालित जमावट analyzers में आम तौर पर निगरानी नहीं की. यह जानकारी थक्का गठन घटना के दौरान FV की भागीदारी की एक पूरी मात्रात्मक मूल्यांकन के अधिक प्रदान करता हैमानव प्लाज्मा में से पहले किया गया है 3-7 की सूचना दी. यह जानकारी दोनों अनुसंधान और नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब प्लाज्मा के नमूनों में FV गतिविधि में या FV या FVA शुद्ध महत्वपूर्ण बदलाव को मापने. FV microplate परख भी विशेषताएँ और यौगिकों कि को सक्रिय या निष्क्रिय हो सकता है FV और FVA उपाय शिरापरक घनास्त्रता के लिए जोखिम में रोगियों में FV गतिविधि को मापने के FV Leiden उत्परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में 20, 21 और की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है FV प्लाज्मा से अपनी शोधन के दौरान. FV microplate आसानी से बाह्य, आंतरिक, या आम मार्ग में किसी भी जमावट कारक की गतिविधि को मापने के लिए अनुकूलनीय परख उपयुक्त प्लाज्मा कारक की कमी का उपयोग कर रहा है और आतंच गठन के लिए अभिकर्मकों की शुरुआत कर रहा है. परख अनुसंधान और नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में अपनी गतिविधि के और अधिक सटीक और पूर्ण माप के माध्यम से FV जैव रसायन की हमारी समझ में वृद्धि होगी. परमly, इस जानकारी पहले निदान और डीआईसी के रूप में जमावट विकारों, से पीड़ित व्यक्तियों के लिए और अधिक प्रभावी उपचार के विकास के माध्यम से सकारात्मक वातावरण स्वास्थ्य को प्रभावित करेगा.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </td></tr><tr><td> काइनेटिक microplate रीडर </td><td> आणविक उपकरणों </td><td> स्पेक्ट्रा 190 अधिकतम </td><td> SOFTmax प्रो 4.3 रास सॉफ्टवेयर </td></tr><tr><td> सामान्य जमा मानव संदर्भ प्लाज्मा </td><td> प्रेसिजन बायोलॉजिकल </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> Trisodium साइट्रेट </td><td> बेक्टन Dickenson </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> बेक्टन Dickenson </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV-कमी मानव प्लाज्मा 4 </td><td></td><td></td><td> ताजा मानव प्लाज्मा से निर्मित है और -70 aliquots में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस </td></tr><tr><td> 3 और 60मिलीलीटर सीरिंज </td><td> बेक्टन Dickenson </td><td> 309585 और 136898 </td><td></td></tr><tr><td> तितली तंत्र </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> 20 गेज </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> / सिग्मा Aldrich </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> मछुआ </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Thromboplastin </td><td> ट्रिनिटी बायोटेक </td><td> T1106 </td><td> Dialyzed बनाम HBS, 7.4 पीएच और -70 पर aliquots में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस </td></tr><tr><td> कैल्सियम क्लोराइड </td><td> बेक्टन Dickenson </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> मानव 15 थ्रोम्बिन </td><td></td><td></td><td> मानव प्लाज्मा से -20 ° सी 50% में (v / v) ग्लिसरॉल में संग्रहीत. </td></tr><tr><td> डायलिसिस झिल्ली </td><td> मछुआ </td><td> 21-152-6 </td><td> 6 8kDa आणविक वजन cutoff, 50mm x 3m. </td></tr><tr><td> टेम्पलेट धारक और हटाने योग्य 8 अच्छी तरह स्ट्रिप्स. </td><td> Nunc </td><td> 14-245-63 और 469957 </td><td></td></tr><tr><td> एलिसा धोने ट्रे </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 मिलीलीटर microfuge और 15 मिलीलीटर पेंच छाया ट्यूबों. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690 और 62554205 </td><td></td></tr><tr><td> Multichannel विंदुक </td><td> मछुआ </td><td> 2703630 </td><td> 8 चैनल मॉडल. </td></tr></tbody></table>

measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

प्रतिनिधि परिणाम FV की तैयारी एक चरण microplate जमावट परख गतिविधि मानक घटता - Microplate रीडर द्वारा उत्पन्न समय पर FV परख में आतंच थक्का गठन के एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 1 में सचित्र है. FV परख सही समय, प्रारंभिक दर और आतंच थक्का गठन की हद उपाय. कुओं की परख पूरा होने पर निरीक्षण की पुष्टि की है कि थक्का गठन हुआ. शुरू करने से पहले absorbance और thromboplastin और कैल्शियम क्लोराइड इसके अलावा के बाद अधिक से अधिक absorbance के बीच 0.45 इकाइयों - सभी प्रतिक्रियाओं absorbance में एक सामान्य परिवर्तन के साथ लगभग थक्का गठन के एक ही 405nm 0.35 हद तक पहुंच गया. FV के प्रतिनिधि उदाहरण 1 चरण लॉग थक्का समय की गतिविधि मानक curves (सेकंड में) बनाम प्रवेश FV गतिविधि (इकाइयों / मिलीलीटर) और थक्का गठन की प्रारंभिक दर प्रवेश है (/ mUnits मिनट में) बनाम प्रवेश FV गतिविधि (इकाइयों / मिलीलीटर NHP के धारावाहिक dilutions के लिए) में दिखाया गया है <strong&gt; चित्रा 2A और चित्रा 2B क्रमशः. FV बनाम लॉग - प्रवेश थक्का समय की साजिश फिटिंग 1 गतिविधि रेखीय प्रतीपगमन विश्लेषण के बाद इन चर के बीच एक मजबूत संबंध का संकेत (चित्रा 2A, आर 2 = 0.980). लॉग - प्रवेश FV गतिविधि बनाम थक्का गठन की प्रारंभिक दर की साजिश फिटिंग भी रेखीय प्रतीपगमन विश्लेषण के बाद इन चर के बीच एक मजबूत संबंध का संकेत (चित्रा 2B, आर 2 = 0.983). दोनों प्रवेश थक्का समय के संबंध और बनाम थक्का गठन प्रवेश FV गतिविधि की प्रारंभिक दर प्रवेश रैखिक बने रहे के लिए NHP 512 गुना तक पतला. चूंकि FV 12 40nm लगभग 16 में NHP में circulates, microplate परख NHP में 24-80pM FV लगभग के प्रति संवेदनशील है. यह देखते हुए कि लिपिड के FVA - FXa prothrombinase में बातचीत की लगातार पृथक्करण 1nm लगभग 17 है, FV microplate परख physiologically प्रासंगिक FV स्तरों के माप के लिए पूरी तरह उपयुक्त हैटी prothrombinase में FVA समारोह के लिए एनएम रेंज. FV microplate परख का उपयोग करना है, यह भी निर्धारित किया गया था के कि FV 1 चरण 15 स्वस्थ नियंत्रण plasmas के गतिविधि परख (पुरुष और महिला, 18-20yrs आयु) में FV गतिविधि के सामान्य श्रेणी (± मानक विचलन, रेंज): 0.96 ± 0.14U/ml, 0.68-1.11U/ml. यह सामान्य स्वस्थ FV गतिविधि और रेंज (0.66-1.14U/ml) कटलर एट अल द्वारा रिपोर्ट के साथ अच्छी तरह से सहमत हैं. FV के लिए एक मंच गतिविधि एक स्वचालित 7 विश्लेषक के साथ निर्धारित है. हद तक, समय के अंतर परख परिवर्तनशीलता और FV 8 अलग अलग दिनों पर 6 कुओं में 1-मंच परख में थक्का गठन के प्रारंभिक दर 3.4%, 4.4%, और 3.1%, क्रमशः था. समय की परिवर्तनशीलता हद तक, अंतर - परख, और FV 8 8 अलग अलग दिनों पर विभिन्न प्रयोगों के 6 कुओं में 1-मंच परख में थक्का गठन की प्रारंभिक दर 7.1%, 7.8%, और 9.2%, क्रमशः था. इस प्रकार, इन तीन measu के अंतर और अंतर - परख परिवर्तनशीलतालाल चर के भीतर और कई नमूने के microplate एक साथ परख के बीच (12) मजबूत परख प्रदर्शन के लिए एक कम और स्वीकार्य स्तर पर था. प्रतिनिधि परिणाम - 1 चरण FV और 2 चरण microplate जमावट परख के साथ मानव प्लाज्मा नमूनों की परख प्रवेश थक्का समय बनाम प्रवेश FV गतिविधि (2A चित्रा) के मानक वक्र NHP और 9 डीआईसी रोगी plasmas में FV गतिविधि जो जोड़ा थ्रोम्बिन (FV गतिविधि 1-चरण) के साथ जानबूझकर सक्रिय थे या जानबूझकर के साथ सक्रिय रहे थे को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था थ्रोम्बिन (FV गतिविधि 2 चरण) और परिणाम तालिका 1 में दिखाया जाता है. सभी 9 डीआईसी रोगी plasmas FV एक मंच गतिविधियों और थक्का गठन के प्रारंभिक दर है कि औसत पर कम थे, 54% और 18%, क्रमशः NHP से, का प्रदर्शन. डीआईसी रोगियों में FV परख 1-चरण में थक्का गठन के विस्तार NHP से काफी हद तक अलग नहीं थे, और औसत पर NHP से 13% से वृद्धि हुई है. <html> थ्रोम्बिन साथ NHP के सक्रियकरण FV में लगभग 8 गुना वृद्धि उत्पन्न FV गतिविधि एक मंच (1 टेबल) के ऊपर 2 चरण गतिविधि. यह इंगित करता है कि NHP में FV अपने unactivated रूप में मुख्य रूप से उपस्थित थे और पहले की रिपोर्ट पुस्तिका झुकाव ट्यूब FV 3 assays, 4 और स्वचालित FV assays 5-7 का उपयोग कर परिणाम के साथ सहमत हैं. 2 चरण FV और कुल गतिविधि भी औसत पर डीआईसी रोगियों में कम थे, 44% और 42%, क्रमशः NHP से. डीआईसी रोगियों में 2 चरण परख FV में थक्का गठन की प्रारंभिक दरें और विस्तार NHP से काफी अलग नहीं थे, और औसत पर लगभग 9% और 4%, क्रमशः, उस से NHP के साथ मनाया, विविध. इन परिणामों से संकेत दिया कि डीआईसी रोगी plasmas में NHP, FV FV के साथ तुलना में एक लंबे समय में हुई है और आतंच थक्का गठन की दर में कमी और रोगी FV औसत पर, के रूप में अच्छी तरह से थ्रोम्बिन के साथ सक्रिय करने के रूप में केवल 56% थी. ent &quot;के लिए: रखने together.within पृष्ठ =&quot; &quot;हमेशा&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="चित्रा 1" /> चित्रा 1 सामान्य जमा मानव संदर्भ गतिज microplate FV 1 चरण जमावट परख के साथ मापा प्लाज्मा में थक्का गठन. आतंच थक्का गठन NHP में लगातार 405nm एक गतिज microplate पाठक का उपयोग पर नजर रखी थी. साजिश 32 गुना पतला NHP, FV-कमी प्लाज्मा, thromboplastin, और एक अच्छी तरह से microplate में कैल्शियम क्लोराइड के एक 6 मिनट प्रतिक्रिया के microplate पाठक उत्पादन है. ऊर्ध्वाधर अक्ष 405nm है कि प्लाज्मा में आतंच गठन के एक परिणाम के रूप में हुई absorbance में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है. आतंच गठन के समय absorbance में आधे से अधिक से अधिक वृद्धि हुई है या वक्र (36.40 सेकंड) के मध्य तक पहुंचने में समय के रूप में परिभाषित किया गया था. थक्का गठन के प्रारंभिक दर 405nm पर 1 5 वक्र (611.88 mUnits / मिनट) के absorbance भाग के रैखिक वृद्धि के समय अंक पर absorbance के परिवर्तन की दर के रूप में परिभाषित किया गया था. पूर्वथक्का गठन के तम्बू 405 एनएम (0.35 यूनिट) में अधिकतम और न्यूनतम absorbance के बीच अंतर के रूप में परिभाषित किया गया था. <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="चित्रा 2" /> चित्रा 2 समय और थक्का गठन बनाम सामान्य जमा मानव संदर्भ प्लाज्मा में फैक्टर वी गतिविधि FV 1 चरण microplate परख का उपयोग कर के प्रारंभिक दर के मानक घटता. NHP serially (0 HBS में 512 गुना) पतला था और 1 चरण microplate परख FV साथ assayed प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में. समय और थक्का गठन बनाम FV में FV गतिविधि 1 चरण microplate परख की प्रारंभिक दर के प्रवेश प्रवेश भूखंडों पैनलों में डेटा के ए और बी, क्रमशः रेखीय प्रतिगमन मॉडलिंग के बाद दिखाए जाते हैं. <table border="1"><tbody><tr><td> नमूना </td><td> एक मंच परख गतिविधि (इकाइयों / मिलीलीटर) </td><td> एक मंच परख का विस्तार (यूनिट) </td><td&gt; 1 चरण परख प्रारंभिक दर (mUnits / मिनट) </td><td> दो चरण परख गतिविधि (इकाइयों / मिलीलीटर) </td><td> दो चरण परख का विस्तार (यूनिट) </td><td> 2 चरण परख प्रारंभिक दर (mUnits / मिनट) </td><td> कुल गतिविधि (इकाइयों / मिलीलीटर) </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1.02 </td><td> 0.363 </td><td> 744.96 </td><td> 7.93 </td><td> 0.433 </td><td> 375.84 </td><td> 6.91 </td></tr><tr><td> 1 रोगी </td><td> 0.36 </td><td> 0.404 </td><td> 583.80 </td><td> 3.84 </td><td> 0.432 </td><td> 249.96 </td><td> 3.48 </td></tr><tr><td> 2 रोगी </td><td> 0.67 </td><td> 0.416 </td><td> 704.04 </td><td> 5.28 </td><td> 0.469 </td><td> 323.16 </td><td> 4.61 </td></tr><tr><td><strong&gt; 3 रोगी </td><td> 0.31 </td><td> 0.435 </td><td> 562.08 </td><td> 3.92 </td><td> 0.453 </td><td> 294.96 </td><td> 3.61 </td></tr><tr><td> 4 रोगी </td><td> 0.39 </td><td> 0.435 </td><td> 617.04 </td><td> 4.14 </td><td> 0.462 </td><td> 372.60 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> 5 रोगी </td><td> 0.73 </td><td> 0.401 </td><td> 641.40 </td><td> 5.91 </td><td> 0.433 </td><td> 354.24 </td><td> 5.18 </td></tr><tr><td> 6 रोगी </td><td> 0.45 </td><td> 0.403 </td><td> 600.72 </td><td> 4.16 </td><td> 0.445 </td><td> 393.96 </td><td> 3.71 </td></tr><tr><td> 7 रोगी </td><td> 0.49 </td><td> 0.395 </td><td> 575.40 </td><td> 4.89 </td><td> 0.449 </td><td> 357.48 </td><td> 4.40 </td></tr><tr><td> 8 रोगी </td><td> 0.19 </td><td> 0.448 </td><td> 489.00 </td><td> 2.89 </td><td> 0.450 </td><td> 330.48 </td><td> 2.70 </td></tr><tr><td> 9 रोगी </td><td> 0.64 </td><td> 0.423 </td><td> 699.48 </td><td> 5.11 </td><td> 0.455 </td><td> 417.24 </td><td> 4.47 </td></tr></tbody></table> टेबल NHP 1 और 9 रोगियों है कि फैलाया intravascular जमावट (डीआईसी) विकसित में FV गतिविधि 1 चरण FV, 2 मंच, और NHP और 9 डीआईसी रोगी plasmas में कुल गतिविधि 1 चरण FV microplate परख मानक से निर्धारित किया गया है FV गतिविधि (2A चित्रा) बनाम थक्का गठन के समय की अवस्था और इकाइयों / मिलीलीटर में दिया जाता है. प्रारंभिक (1 पाँच mUnits / मिनट में समय अंक पर A405nm में वृद्धि की प्रारंभिक दर) दरों में और विस्तार (अधिकतम A405nm न्यूनतम A401 FV में थक्का गठन के) 5nm और 2 चरण microplate परख भी दिखाए जाते हैं.

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Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

इस अध्ययन के एक उपन्यास microplate परख कि मानव प्लाज्मा में आतंच थक्का गठन है जो पहले नहीं बताया गया है के दौरान FV जमावट गतिविधि उपाय का वर्णन करता है. 405nm पर मानव प्लाज्मा में आतंच थक्का गठन के दौरान लगातार absorbance में बदलने के उपाय के लिए एक गतिज microplate पाठक विधि का उपयोग करता है.

फैक्टर मानव प्लाज्मा में वी गतिविधि के मापन एक microplate जमावट परख का उपयोग

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