Name: a primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation
Uploaded: 2012-04-02T13:00:00
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Agradecemos aos revisores por suas sugestões inteligentes que ajudaram a melhorar este manuscrito. Este trabalho foi suportado por concessões para MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) e IM (AI073898, GM056927) do NIH. MK foi apoiado em parte por um treinamento NIH subvenção (5T32 AI007180).

1. Isolamento e cultura de neurônios Scg de embriões de ratos Para proporcionar um contexto útil para a compreensão deste protocolo, e para uma discussão exaustiva da literatura anteriormente que métodos estabelecidos de SCG cultura neurónio, incluindo a base para SCG cultura in vitro, a placa de revestimento de substrato, e os componentes de meios isentos de soro, o leitor é remetido para referências de 2-4. <ol><li> O uso de ratos como uma fonte para os neur?...

<ol>
	<li>Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+duration+of+growth+factor+signaling+through+receptor+tyrosine+kinases+regulates+HSV-1+latency+in+neurons.">Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons.</a> Cell Host &#38; Microbe. 8, 320-330 (2010).</li><li>Johnson, M. I., Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+sympathetic+ganglia.">Primary cultures of sympathetic ganglia.</a> Protocols for Neural Cell Culture. , 71-94 (2001).</li><li>Letourneau, P. C., Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+substrata+for+in+vitro+culture+of+neurons.">Preparation of substrata for in vitro culture of neurons.</a> Protocols for Neural Cell Culture. , 245-254 (2001).</li><li>Price, J. P., Brewer, G. J., Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+media+for+neural+cell+cultures.">Serum-free media for neural cell cultures.</a> Protocols for Neural Cell Culture. , 255-264 (2001).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+and+functional+comparison+of+the+latency-associated+transcript+promoters+of+herpes+simplex+virus+type+1+strains+KOS+and+McKrae.">A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae.</a> J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).</li><li>Stroop, W. G., Banks, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS-63+does+not+cause+acute+or+recurrent+ocular+disease+and+does+not+reactivate+ganglionic+latency+in+vivo.">Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo.</a> Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).</li><li>Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+latent+herpes+simplex+virus+type+1+genome+copy+number+in+individual+neurons+is+virus+strain+specific+and+correlates+with+reactivation.">The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation.</a> J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).</li><li>Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+analysis+of+the+avirulent+wild-type+herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS.">Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS.</a> J. Virol. 58, 203-211 (1986).</li><li>Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor-dependence+of+herpes+simplex+virus+latency+in+peripheral+sympathetic+and+sensory+neurons+in+vitro.">Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro.</a> J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).</li><li>Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+vestibular+ganglion+neurons+demonstrate+latent+herpes+simplex+type+I+reactivation.">Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation.</a> Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).</li><li>Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culture+model+of+facial+palsy+resulting+from+reactivation+of+latent+herpes+simplex+virus+type+1.">A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1.</a> Otology &#38; Neurotology. , (2012).</li></ol>

Esta cultura neurônio primário e sistema de infecção fornece um método simples e eficaz para explorar os mecanismos moleculares subjacentes HSV-1 latência e reativação. O sistema fielmente recapitula as características aceitas de latência definidos em ambas as infecções humanas e em modelos de animais vivos. Quando o vírus é latente nas culturas SCG, partículas virais infecciosas e produtos de genes líticas não pode ser detectado. O produto do gene virai detectado apenas em neurónios l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 70μm nylon filtro (coador de celular) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Solução 1x Salina Equilibrada de Hank (HBSS - / -) </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> w / o CaCl 2 e MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1x mínimos Mídia Essenciais (MEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11095-080 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2&#39;-desoxiuridina </td><td> Sigma </td><td> F0503 </td><td> preparar 20 mM em 1x MEM; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> 96-bem planas bem fundo placas TC </td><td> Corning </td><td> 3599 </td><td></td></tr><tr><td> Aciclovir </td><td> &lt;em&gt; Calbiochem </td><td> 114798 </td><td> preparar 31 mM em DMSO; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Afidicolina </td><td> Calbiochem </td><td> 178273 </td><td> preparar 10 mM em DMSO; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> B-27 Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-44 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Sigma </td><td> C2674 </td><td> preparar 10 mg / ml em HBSS estoque - / -; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> preparar estoque 40% em H 2 O; filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> A laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td><td> preparar 1 mg / ml em estoque H 2O; rápido a congelar 20 laliquats e armazenar a -80 ° C; diluído para 2 mg / ml conc de trabalho. em estéril de H2O </td></tr><tr><td> Leibovit&#39;z meio L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Fator de Crescimento do Nervo </td><td> Harlan Laboratories </td><td> BT.5017 </td><td> preparar 50 ug / ml em HBSS estoque - / -; armazenam a -80 ° C </td></tr><tr><td> Médio Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfonoacético ácido (PAA) </td><td> Sigma </td><td> P6909 </td><td> preparar 75 mg / ml estoque em H2O; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina bromidrato </td><td> Sigma </td><td> P0899 </td><td> preparar 20 mg / ml estoque em H2O; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Rat-tail de colágeno </td><td> Millipore </td><td> 08-115 </td><td>Concentração varia com o lote de abastecimento; Armazenar a 4 ° C e diluída para 0,66 mg / ml conc de trabalho. em estéril de H2O </td></tr><tr><td> Tricostatina A </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td> preparar 1 mM em DMSO; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Tripsina 2,5% </td><td> Invitrogen </td><td> 15090-04 </td><td></td></tr></tbody></table>

a primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation

Herpes simplex virus tipo-1 (HSV-1) estabelece uma infecção latente ao longo da vida em neurónios periféricos. Este reservatório latente é a fonte de eventos de reactivação recorrentes que assegurar a transmissão e contribuir para doença clínica. Antivirais atuais não impactar o reservatório latente e não existem vacinas. Embora os detalhes moleculares de replicação lítica são bem caracterizados, mecanismos de controle de latência nos neurônios permanecem ainda desconhecidos. A nossa compreensão actual de latência é derivado a partir de estudos in vivo utilizando modelos animais pequenos, que têm sido indispensáveis ​​para definir os requisitos de genes virais e do papel de respostas imunes. No entanto, é impossível distinguir efeitos específicos sobre a relação vírus neurónio-a partir de consequências mais gerais de infecção mediada por células de suporte imunes ou não-neuronais em animais vivos. Além disso, a experimentação animal é dispendiosa, morosa, e limitado em termos de opções disponíveis para a manipulação de acolhimentoprocessos. Para superar essas limitações, um sistema de neurônios-só é desesperadamente necessário que reproduz a características in vivo de latência e reativação, mas oferece os benefícios da cultura de tecidos em termos de homogeneidade e de acessibilidade. Apresentamos aqui mais um modelo in vitro utilizando culturas de neurónios simpáticos primárias a partir de gânglios rato cervical superior (SCG) (Figura 1) para estudar o HSV-1 latência e reactivação que se encaixa se não de todos os critérios desejados. Depois de eliminar células não-neuronais, perto homogéneos TrkA culturas + de neurónios são infectadas com HSV-1 na presença de aciclovir (ACV) para suprimir a replicação lítica. Remoção ACV seguinte, não produtivos HSV-1 infecções que exibem características fielmente aceites de latência são eficientemente estabelecida. Notavelmente, os mRNAs líticas, proteínas, e vírus infeccioso tornar-se indetectável, mesmo na ausência de selecção, mas a latência associada transcrição (LAT) expressaion persiste em núcleos neuronal. Genomas virais são mantidas a um número de cópias médio de 25 por neurónio e podem ser induzidas a produtivamente replicar por interferir com PI3-quinase / sinalização Akt ou a retirada simples do factor de crescimento do nervo 1. Um recombinante HSV-1 EGFP codificação fundido com a proteína viral lítica US11 fornece um funcional, marcador de tempo real para a replicação resultante da reactivação que é facilmente quantificado. Além disso a tratamentos químicos, as metodologias genéticas tais como a entrega de RNA-interferência ou gene através lentivirais pode ser aplicado com sucesso para o sistema que permite estudos mecanísticos que são muito difíceis, se não impossível, em animais. Em resumo, a SCG baseado HSV-1 sistema de latência / reativação fornece uma poderosa ferramenta necessária para desvendar os mecanismos moleculares que controlam HSV1 latência e reativação de neurônios, um enigma de longa data em virologia cuja solução pode oferecer novas perspectivas no desenvolvimento de novas terapias que alvo tele latente reservatório herpesvírus.

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A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

O protocolo descreve um sistema de modelo eficiente e reprodutível para estudar vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) a latência e reactivação. O ensaio emprega homogéneos culturas de neurónios simpáticos e permite a dissecção molecular do vírus de neurónios-interacções usando uma variedade de ferramentas, incluindo a interferência de RNA e de expressão de proteínas recombinantes.

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Imunologia e Infecção

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mouse e humanos derivada de cultura de monocamada epitelial gástrica primária para o estudo da regeneração

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Um modelo de cultura primária de células bolsas serosas Ex Vivo frango para estudar a patogênese de doenças infecciosas bolsas serosas vírus

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Análise temporal de translocação Nuclear e citoplasmática de uma Herpes Simplex vírus 1 proteína pela microscopia Confocal imunofluorescência

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

eletroporação siRNA para modular a autofagia em herpes simplex vírus tipo 1 infectado monocyte derivados células dendríticas

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...