Name: cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel
Uploaded: 2012-01-11T12:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier Norman Krüger pour son excellent support technique.

1. Partie 1: Culture de hNPCs dans PuraMatrix <ol><li> À l&#39;avance pour la génération d&#39;un échafaudage avec une concentration de 0,25% PuraMatrix sans laminine on a besoin pour préparer les solutions suivantes </li><li> Préparer une solution contenant du saccharose à 20% et une solution contenant 10% de saccharose dissous dans de l&#39;eau distillée stérile. </li><li> Pour la solution 1 mix 120 pl de la solution de saccharose à 20% avec 120 pi d&#39;eau distillée dans un tube de 1,5 ml conique. </li>...

<ol>
	<li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li><li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine.">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+building+a+better+matrix.">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li><li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials.">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li><li>Teng, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+mediated+by+a+unique+polymer+scaffold+seeded+with+neural+stem+cells.">Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).</li><li>Silva, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers.">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303, 1352-1355 (2004).</li><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).</li><li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures.">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li><li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane.">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+oligopeptide+matrices+support+mammalian+cell+attachment.">Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment.</a> Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).</li><li>Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+significantly+enhance+osteoblast+proliferation,+differentiation+and+3-D+migration.">Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration.</a> PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).</li><li>Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+of+human+fetal+neural+stem+cells+with+hydrogel+biomaterials+in+vitro.">Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro.</a> Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).</li><li>Ortinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).</li><li>Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PuraMatrix+Encapsulation+of+Cancer+Cells.">PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).</li><li>Morgan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+neurons+derived+from+human+neural+progenitor+cells+by+veratridine.">Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine.</a> Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).</li><li>Giese, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+the+effect+of+oxygen+during+proliferation+and+differentiation+of+human+neural+progenitor+cells.">Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells.</a> BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).</li><li>Schm&#246;le, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+indolylmaleimide+acts+as+GSK-3beta+inhibitor+in+human+neural+progenitor+cells.">Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).</li><li>PuraMatrix, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Hydrogel.">Peptide Hydrogel.</a> Guidelines for Use. Catalog No 354250, (2006).</li></ol>

L&#39;utilisation de la 3D-échafaudages offre l&#39;opportunité d&#39;étudier le développement de différents types de cellules dans une situation de culture cellulaire plus proche de la situation in vivo. Toutefois, concernant l&#39;analyse de la différenciation neuronale par exemple ou des études fonctionnelles on doit surmonter certains obstacles pour obtenir des données fiables pour la quantification, par exemple des types de cellules. Ici, nous décrit la cultur...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> PuraMatrix peptide hydrogel </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Souris laminine, je </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de chèvre normal </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Hanks Balanced Salt Solution 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII-tubuline anticorps </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51670 </td><td> Souris, monoclonaux, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11029 </td><td> Chèvre α souris, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11031 </td><td> Chèvre α souris, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21235 </td><td> Chèvre α souris, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 réactif </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane de 98% </td></tr><tr><td> Tamis cellulaire </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 taille des pores um </td></tr><tr><td> La saponine </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / ul </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibiteur de la trypsine </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% HSA </td><td> Octapharma </td><td> Homme-albumine Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

L&#39;influence des trois dimensions (3D) des échafaudages sur la différenciation de croissance, la prolifération neuronale et finalement un grand intérêt dans le but de trouver de nouvelles méthodes pour les thérapies cellulaires et standardisée dans les troubles neurologiques ou de maladies neurodégénératives. Structures 3D sont censés fournir un environnement beaucoup plus proche de la situation in vivo que les cultures en 2D. Dans le contexte de la médecine régénérative, la combinaison des échafaudages biomatériau souches neurales et de cellules progénitrices est très prometteur comme outil thérapeutique. 1-5 Systèmes de culture émuler un environnement en trois dimensions a été démontré que l&#39;influence la prolifération et la différenciation dans les différents types de souches et cellules progénitrices. Ici, la formation et la fonctionnalisation de la 3D-microenviroment est important de déterminer la survie et le devenir des cellules intégrées 6-8. Ici nous avons utilisé PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), un peptide hydrogel à base d&#39;échafaudage,ce qui est bien décrite et utilisée pour étudier l&#39;influence d&#39;un environnement en 3D sur différents types cellulaires. 7,11-14 PuraMatrix peut être personnalisé facilement et la fabrication synthétique de la nano-fibres fournit un système de culture 3D de haute fiabilité, qui est en outre xéno-libres. Récemment, nous avons étudié l&#39;influence de la concentration en PM-sur la formation de l&#39;échafaud. 13 Dans cette étude, les concentrations de PM utilisés ont eu un impact direct sur ​​la formation de la structure 3D, qui a été démontré par microscopie à force atomique. Une analyse ultérieure de la survie et la différenciation des hNPCs révélé une influence des concentrations de PM utilisés sur le sort des cellules embarquées. Cependant, l&#39;analyse de la survie ou la différenciation neuronale par des techniques d&#39;immunofluorescence posséder quelques obstacles. Pour obtenir des données fiables, on doit déterminer le nombre total de cellules dans une matrice afin d&#39;obtenir le nombre relatif de par exemple. cellules neuronales marquée par βIII-tubuline. Ce prérequis d&#39;une technique pour analyser les échafaudages dans toutes les dimensions de 3 par un microscope confocal ou une technique comparable, comme des microscopes à fluorescence en mesure de prendre z-piles de l&#39;échantillon. En outre, ce type d&#39;analyse est beaucoup de temps. Ici nous démontrons une méthode pour libérer les cellules de la échafaudages 3D pour l&#39;analyse ultérieure, par exemple par cytométrie en flux. Dans ce protocole humains cellules progénitrices neurales (hNPCs) de la ligne de cellules ReNcell VM (Millipore Etats-Unis) ont été cultivées et différenciées en 3D composé d&#39;échafaudages PuraMatrix (PM) ou PuraMatrix complétée par la laminine (LEMP). Dans nos mains un PM-concentration de 0,25% a été optimale pour la culture des 13 cellules, cependant l&#39;opération pourrait être adapté à d&#39;autres types cellulaires. 12 Les cellules libérées peuvent être utilisées par exemple pour des études immunocytochimiques et ensuite analysés par cytométrie en flux. Cela accélère l&#39;analyse et la more plus, le reste des données obtenues sur une base plus large, l&#39;amélioration de la fiabilité des données.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Nous décrivons ici l&#39;utilisation d&#39;un auto-assemblage en 3 dimensions d&#39;échafaudage à la culture humaine cellules progénitrices neurales. Nous présentons un protocole visant à libérer les cellules de la échafaudages pour être analysés ultérieurement, par exemple par cytométrie en flux. Ce protocole pourrait être adapté à d&#39;autres types cellulaires pour effectuer des études détaillées de façon mécaniste.

La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

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