Name: cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel
Uploaded: 2012-01-11T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Norman Krüger for hans utmerkede teknisk støtte.

1. Del 1: Culture of hNPCs i PuraMatrix <ol><li> På forhånd til generering av et stillas med en PuraMatrix konsentrasjon på 0,25% uten laminin man trenger å forberede seg følgende løsninger </li><li> Forbered en løsning som inneholder 20% sukrose og en løsning som inneholder 10% sukrose oppløst i sterilt destillert vann. </li><li> For løsningen en blanding 120 mL av de 20% sukroseløsning med 120 mL destillert vann i en 1,5 ml konisk tube. </li><li> For løsning 2 mix 60 mL av PuraMatrix løsningen med 60 mL...

<ol>
	<li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li><li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine.">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+building+a+better+matrix.">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li><li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials.">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li><li>Teng, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+mediated+by+a+unique+polymer+scaffold+seeded+with+neural+stem+cells.">Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).</li><li>Silva, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers.">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303, 1352-1355 (2004).</li><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).</li><li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures.">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li><li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane.">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+oligopeptide+matrices+support+mammalian+cell+attachment.">Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment.</a> Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).</li><li>Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+significantly+enhance+osteoblast+proliferation,+differentiation+and+3-D+migration.">Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration.</a> PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).</li><li>Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+of+human+fetal+neural+stem+cells+with+hydrogel+biomaterials+in+vitro.">Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro.</a> Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).</li><li>Ortinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).</li><li>Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PuraMatrix+Encapsulation+of+Cancer+Cells.">PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).</li><li>Morgan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+neurons+derived+from+human+neural+progenitor+cells+by+veratridine.">Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine.</a> Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).</li><li>Giese, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+the+effect+of+oxygen+during+proliferation+and+differentiation+of+human+neural+progenitor+cells.">Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells.</a> BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).</li><li>Schm&#246;le, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+indolylmaleimide+acts+as+GSK-3beta+inhibitor+in+human+neural+progenitor+cells.">Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).</li><li>PuraMatrix, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Hydrogel.">Peptide Hydrogel.</a> Guidelines for Use. Catalog No 354250, (2006).</li></ol>

Bruken av 3D-stillasene tilbyr muligheten til å studere utviklingen av ulike celletyper i en cellekultur situasjon nærmere in vivo situasjonen. Men når det gjelder analyse av f.eks neuronal differensiering eller funksjonelle studier man må overvinne noen hindringer for å få pålitelige data for f.eks kvantifisering av celletyper. Her har vi beskrev kultur hNPCs i peptid hydrogel basert stillas PuraMatrix og senere utgivelsen av cellene som skal brukes til studier i en 2D-situa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> PuraMatrix peptid hydrogel </td><td> BD Biovitenskap </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Mus laminin jeg </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Sukrose </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Normal geit serum </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII-tubulin antistoff </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51670 </td><td> Mus, monoklonalt, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> En 11 029 </td><td> Goat α mus, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> En 11 031 </td><td> Goat α mus, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> En 21 235 </td><td> Goat α mus, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 Reagens </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-Diazabicyclo [2.2.2] oktan 98% </td></tr><tr><td> Cell sil </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 mikrometer porestørrelse </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / mikroliter </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin Inhibitor </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% HSA </td><td> Octapharma </td><td> Human-Albumin Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

Påvirkningen av 3-dimensjonale (3D) stillasene på vekst, spredning og til slutt neuronal differensiering er av stor interesse for å finne nye metoder for celle-baserte og standardiserte terapier i nevrologiske lidelser eller nevrodegenerative sykdommer. 3D strukturer forventes å gi et miljø mye nærmere in vivo situasjon enn 2D kulturer. I forbindelse med regenerativ medisin, har kombinasjonen av biomateriale stillasene med nevrale stamceller og progenitorceller store løftet som et terapeutisk verktøy. 1-5 Kultur systemer som emulerer en tredimensjonal miljø har vist seg å påvirke spredning og differensiering i ulike typer stamceller og stamceller. Heri, er dannelsen og funksjonalisering av 3D-microenviroment viktig å bestemme overlevelse og skjebnen til den innebygde cellene. 6-8 Her har vi brukt PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), et peptid basert hydrogel stillaset,som er godt beskrevet og brukt til å studere påvirkning av et 3D-miljø på ulike celletyper. 7,11-14 PuraMatrix kan tilpasses enkelt og den syntetiske fabrikasjon av nano-fibrene gir en 3D-kultur system av høy pålitelighet, noe som er i tillegg Xeno-free. Nylig har vi studert påvirkning av PM-konsentrasjonen på dannelsen av stillaset. 13. I denne studien brukes konsentrasjoner av PM hadde en direkte innvirkning på dannelsen av 3D-struktur, som ble demonstrert av atomic force mikroskopi. En etterfølgende analyse av overlevelse og differensiering av hNPCs avslørte en påvirkning av den brukte konsentrasjoner av PM på skjebnen til den innebygde celler. Men analyse av overlevelse eller neuronal differensiering ved hjelp av immunfluorescens teknikk posses noen hindringer. For å få pålitelige data, må man bestemme det totale antall celler innenfor en matrise for å få relative antallet av f.eks. neuronal celler preget av βIII-tubulin. Dette forutsetningene en teknikk for å analysere stillasene i alle tre dimensjoner av en confocal mikroskop eller en tilsvarende teknikk som fluorescens mikroskop kunne ta z-stabler av prøven. Videre er denne typen analyse er svært tidkrevende. Her vil vi vise en metode for å frigjøre celler fra 3D-stillaser for senere analyser eksempel ved flowcytometri. I denne protokollen humane nevrale stamceller (hNPCs) av ReNcell VM cellelinje (Millipore USA) ble dyrket og differensiert i 3D-stillasene bestående av PuraMatrix (PM) eller PuraMatrix supplert med laminin (PML). I våre hender en PM-konsentrasjon på 0,25% var optimale for dyrking av cellene 13, men konsentrasjonen kan tilpasses andre celletyper. 12. sluppet cellene kan brukes til f.eks immunocytochemical studier og senere analysert ved flowcytometri. Dette hastigheter opp analyse og more over, innhentet data hviler på en bredere base, forbedre påliteligheten av data.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel at JoVE.com

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Her beskriver vi bruk av en selv-montering 3-dimensjonale stillas til kultur menneskelige nevrale stamceller. Vi presenterer en protokoll for å frigjøre cellene fra stillasene for å bli analysert senere for eksempel ved flowcytometri. Denne protokollen kan tilpasses andre celletyper å utføre detaljerte mechanistically studier.

Dyrking av Human Neural stamceller i en 3-dimensjonal Self-montering Peptid Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Elektrisk felt-kontrollert Regissert Migrasjon av Neural stamceller i 2D og 3D miljøer

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Egenrapportering Stillaser for 3-dimensjonal Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntese av en Intein-mediert Kunstig Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Dyrking av pattedyrceller med en enkelt-bruk Pneumatisk Bioreaktor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Forbedret 3D Hydrogel kulturer av primære gliacellene for In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrking pattedyrceller i tredimensjonale peptid stillaser

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Hyaluronsyre basert Hydrogels for 3-dimensjonale kultur pasient-avledede glioblastom celler

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...