Name: cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel
Uploaded: 2012-01-11T12:00:00
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Os autores gostariam de agradecer a Norman Krüger para o seu excelente suporte técnico.

1. Parte 1: Cultura da hNPCs em PuraMatrix <ol><li> Com antecedência, para a geração de um andaime com uma concentração de 0,25% PuraMatrix sem laminina, é necessário preparar as seguintes soluções </li><li> Prepare uma solução contendo sacarose 20% e uma solução contendo 10% de sacarose dissolvida em água destilada estéril. </li><li> Para solução 1 ml mix 120 da solução de sacarose 20% com 120 mL de água destilada em um tubo de 1,5 ml cônico. </li><li> Para a solução 2 mL mix 60 do PuraMatrix s...

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	<li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li><li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine.">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+building+a+better+matrix.">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li><li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials.">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li><li>Teng, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+mediated+by+a+unique+polymer+scaffold+seeded+with+neural+stem+cells.">Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).</li><li>Silva, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers.">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303, 1352-1355 (2004).</li><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).</li><li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures.">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li><li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane.">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+oligopeptide+matrices+support+mammalian+cell+attachment.">Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment.</a> Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).</li><li>Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+significantly+enhance+osteoblast+proliferation,+differentiation+and+3-D+migration.">Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration.</a> PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).</li><li>Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+of+human+fetal+neural+stem+cells+with+hydrogel+biomaterials+in+vitro.">Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro.</a> Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).</li><li>Ortinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).</li><li>Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PuraMatrix+Encapsulation+of+Cancer+Cells.">PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).</li><li>Morgan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+neurons+derived+from+human+neural+progenitor+cells+by+veratridine.">Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine.</a> Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).</li><li>Giese, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+the+effect+of+oxygen+during+proliferation+and+differentiation+of+human+neural+progenitor+cells.">Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells.</a> BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).</li><li>Schm&#246;le, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+indolylmaleimide+acts+as+GSK-3beta+inhibitor+in+human+neural+progenitor+cells.">Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).</li><li>PuraMatrix, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Hydrogel.">Peptide Hydrogel.</a> Guidelines for Use. Catalog No 354250, (2006).</li></ol>

O uso do 3D-scaffolds oferece a oportunidade de estudar o desenvolvimento de diferentes tipos de células em uma situação de cultura de células mais perto a situação in vivo. No entanto, quanto à análise da diferenciação neuronal por exemplo, ou estudos funcionais é preciso superar alguns obstáculos para obtenção de dados confiáveis ​​para quantificação por exemplo, de tipos de células. Aqui descrevemos a cultura de hNPCs no hidrogel baseada peptídeo s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> PuraMatrix hidrogel peptídeo </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Rato laminina I </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Solução de Hanks salina balanceada 1X </td></tr><tr><td&gt; Anticorpo βIII-tubulina </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51670 </td><td> Mouse, monoclonal, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11.029 </td><td> Cabra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11.031 </td><td> Cabra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21.235 </td><td> Cabra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol Reagente 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano 98% </td></tr><tr><td> Coador celular </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 mM tamanho dos poros </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / mL </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% HSA </td><td> Octapharma </td><td> A albumina humana-Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

A influência de três dimensões (3D) andaimes em diferenciação, proliferação, crescimento e finalmente neuronal é de grande interesse, a fim de encontrar novos métodos de terapias baseadas em células e padronizado em distúrbios neurológicos ou doenças neurodegenerativas. Estruturas 3D são esperados para proporcionar um ambiente muito mais próximo da situação in vivo do que as culturas 2D. No contexto da medicina regenerativa, a combinação de andaimes biomaterial com tronco neurais e células progenitoras é uma grande promessa como uma ferramenta terapêutica. 1-5 sistemas Cultura emular um ambiente tridimensional foram mostrados para influenciar a proliferação e diferenciação em diferentes tipos de caule e células progenitoras. Aqui, a formação e funcionalização do 3D microenviroment é importante para determinar a sobrevivência e destino das células incorporado. 6-8 Aqui usamos PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), um peptídeo com base hidrogel andaime,que é bem descrito e utilizado para estudar a influência de um ambiente 3D sobre diferentes tipos celulares. 7,11-14 PuraMatrix podem ser facilmente personalizados ea fabricação sintética do nano-fibras fornece um sistema de cultura 3D de alta confiabilidade, que é, além xeno-free. Recentemente, têm estudado a influência da concentração de PM-sobre a formação do andaime. 13 Neste estudo as concentrações utilizadas da PM teve um impacto direto sobre a formação da estrutura em 3D, que foi demonstrada por microscopia de força atômica. Uma análise posterior da sobrevivência e diferenciação dos hNPCs revelou uma influência das concentrações utilizadas da PM sobre o destino das células incorporado. No entanto, a análise de sobrevida ou diferenciação neuronal por meio de técnicas de imunofluorescência possuir alguns obstáculos. Para obter dados confiáveis, é preciso determinar o número total de células dentro de uma matriz para obter o número relativo de exemplo. células neuronais marcados por βIII-tubulina. Este pré-requisitos de uma técnica para analisar os andaimes em todas as dimensões de 3 por um microscópio confocal ou uma técnica comparável como microscópios de fluorescência capaz de tomar z-stacks da amostra. Além disso, este tipo de análise é extremamente demorado. Aqui demonstramos um método para liberar as células dos andaimes 3D para a análise posterior por exemplo, por citometria de fluxo. Neste protocolo células progenitoras neurais (hNPCs) da linha celular ReNcell VM (Millipore EUA) foram cultivadas e diferenciadas em 3D-scaffolds consistindo de PuraMatrix (PM) ou PuraMatrix suplementado com laminina (PML). Em nossas mãos um PM-concentração de 0,25% foi ideal para o cultivo das 13 células, no entanto, a concentração pode ser adaptado para outros tipos celulares. 12 As células liberado pode ser usado para, por exemplo estudos imunocitoquímicos e posteriormente analisadas por citometria de fluxo. Isso acelera a análise e more mais, o resto os dados obtidos sobre uma base mais ampla, melhorando a confiabilidade dos dados.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Aqui nós descrevemos o uso de uma auto-montagem 3-dimensional andaime para a cultura humana células progenitoras neurais. Nós apresentamos um protocolo para liberar as células da scaffolds a serem analisados ​​posteriormente por exemplo, por citometria de fluxo. Este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células para realizar estudos detalhados mecanicamente.

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

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