Name: cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel
Uploaded: 2012-01-11T12:00:00
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Los autores desean agradecer a Norman Krüger por su excelente apoyo técnico.

1. Parte 1: Cultura de hNPCs en PuraMatrix <ol><li> De antelación a la generación de un andamio con una concentración de 0,25% PuraMatrix sin laminina que se necesita para preparar las siguientes soluciones </li><li> Prepare una solución de sacarosa al 20% y una solución que contenga 10% de sacarosa disuelta en agua destilada estéril. </li><li> Para la solución de una mezcla de 120 l de la solución de sacarosa al 20% con 120 l de agua destilada en un tubo de 1,5 ml cónico. </li><li> Para la solución de dos m...

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	<li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li><li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine.">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+building+a+better+matrix.">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li><li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials.">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li><li>Teng, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+mediated+by+a+unique+polymer+scaffold+seeded+with+neural+stem+cells.">Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).</li><li>Silva, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers.">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303, 1352-1355 (2004).</li><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).</li><li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures.">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li><li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane.">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+oligopeptide+matrices+support+mammalian+cell+attachment.">Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment.</a> Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).</li><li>Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+significantly+enhance+osteoblast+proliferation,+differentiation+and+3-D+migration.">Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration.</a> PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).</li><li>Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+of+human+fetal+neural+stem+cells+with+hydrogel+biomaterials+in+vitro.">Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro.</a> Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).</li><li>Ortinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).</li><li>Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PuraMatrix+Encapsulation+of+Cancer+Cells.">PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).</li><li>Morgan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+neurons+derived+from+human+neural+progenitor+cells+by+veratridine.">Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine.</a> Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).</li><li>Giese, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+the+effect+of+oxygen+during+proliferation+and+differentiation+of+human+neural+progenitor+cells.">Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells.</a> BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).</li><li>Schm&#246;le, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+indolylmaleimide+acts+as+GSK-3beta+inhibitor+in+human+neural+progenitor+cells.">Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).</li><li>PuraMatrix, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Hydrogel.">Peptide Hydrogel.</a> Guidelines for Use. Catalog No 354250, (2006).</li></ol>

El uso de andamios 3D ofrece la oportunidad de estudiar el desarrollo de diferentes tipos de células en una situación de cultivo celular más cercana a la situación in vivo. Sin embargo, en relación con el análisis de la diferenciación neuronal por ejemplo, o estudios funcionales que uno tiene que superar algunos obstáculos para obtener datos fiables para la cuantificación por ejemplo, de tipos de células. Aquí se describe la cultura de hNPCs en el hidrogel basado...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> PuraMatrix péptido hidrogel </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón laminina I </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma </td><td> S9378-1kg </td><td></td></tr><tr><td> Suero normal de cabra </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Solución salina equilibrada de Hanks 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII-tubulina de anticuerpos </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51 670 </td><td> Ratón, monoclonal, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11029 </td><td> Cabra α del ratón, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11031 </td><td> Cabra α del ratón, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21235 </td><td> Cabra α del ratón, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 Reactivo </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano 98% </td></tr><tr><td> Células colador </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 micras de tamaño de poro </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / l </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibidor de la tripsina </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% de HSA </td><td> Octapharma </td><td> La albúmina humana-Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

La influencia de tres dimensiones (3D) los andamios en la diferenciación de crecimiento, la proliferación neuronal y por último es de gran interés con el fin de encontrar nuevos métodos de terapias basadas en células y estandarizada en las enfermedades neurológicas o enfermedades neurodegenerativas. Estructuras 3D se espera que proporcionen un ambiente mucho más cercano a la situación in vivo de las culturas en 2D. En el contexto de la medicina regenerativa, la combinación de biomateriales con madre neurales y las células progenitoras es una gran promesa como una herramienta terapéutica. 1.5 Los sistemas de cultivo que simula un entorno tridimensional se ha demostrado que influyen en la proliferación y diferenciación en diversos tipos de células madre y las células progenitoras. En esto, la formación y funcionalización de la 3D-microenviroment es importante para determinar la supervivencia y el destino de las células incrustado. 6-8 Aquí usamos PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), un péptido de hidrogel a base de andamios,que está bien descrito y utilizado para estudiar la influencia de un entorno 3D en diferentes tipos celulares. 7,11-14 PuraMatrix se pueden personalizar fácilmente y la fabricación sintética de la nano-fibras proporciona un sistema de cultivo en 3D de alta fiabilidad, que es, además de xeno-libre. Recientemente se ha estudiado la influencia de la concentración de PM-en la formación del andamio. 13 En este estudio las concentraciones utilizadas de PM tuvo un impacto directo sobre la formación de la estructura 3D, que fue demostrado por microscopía de fuerza atómica. Un posterior análisis de la supervivencia y la diferenciación de la hNPCs reveló una influencia de las concentraciones utilizadas de PM en el destino de las células incrustado. Sin embargo, el análisis de la supervivencia o la diferenciación neuronal por medio de técnicas de inmunofluorescencia poseen algunos obstáculos. Para obtener datos fiables, hay que determinar el número total de células en una matriz para obtener el número relativo de ejemplo. células neuronales marcados por βIII-tubulina. Este pre-requisitos de una técnica para analizar los andamios en todas las dimensiones de 3 por un microscopio confocal o una técnica comparable como los microscopios de fluorescencia capaces de tomar z-pilas de la muestra. Además, este tipo de análisis es extremadamente lento. Aquí se demuestra un método para liberar las células de los andamios en 3D-por ejemplo, para el posterior análisis por citometría de flujo. En este protocolo las células progenitoras neurales (hNPCs) de la línea celular ReNcell VM (Millipore EE.UU.) se cultivaron y se diferencian en 3D andamios que consiste en PuraMatrix (PM) o PuraMatrix complementado con la laminina (PML). En nuestras manos un PM-concentración de 0,25% fue óptimo para el cultivo de las 13 células, sin embargo, la concentración puede ser adaptado a otros tipos de células. 12 Las células liberadas pueden ser utilizados para, por ejemplo estudios inmunocitoquímicos y posteriormente analizados por citometría de flujo. Esto acelera el análisis y la movolver otra vez, el resto de datos obtenidos sobre una base más amplia, la mejora de la fiabilidad de los datos.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

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